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內(nèi)容提要

近年來，社會壓力的增加和其他因素導(dǎo)致抑郁癥患者人數(shù)的激增。目前，普遍認(rèn)為嚴(yán)重抑郁癥的內(nèi)因是腦組織去甲腎上腺素(NE)水平降低。去甲腎上腺素與另外兩種兒茶酚胺神經(jīng)遞質(zhì)——腎上腺素(EP)和多巴胺(DA)在結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)上非常相似。這三種神經(jīng)遞質(zhì)在生物系統(tǒng)中通過酶反應(yīng)依次合成。因此，設(shè)計去甲腎上腺素特異性熒光探針具有一定的挑戰(zhàn)性。作者采用了“保護(hù)-去保護(hù)”策略：長發(fā)射波長含水溶性磺酸的花菁被硫代碳酯保護(hù)，去甲腎上腺素β-羥基乙基胺通過親核取代和分子內(nèi)親核環(huán)化反應(yīng)釋放熒光團(tuán)。該策略實現(xiàn)了去甲腎上腺素的特異性紅色熒光檢測，以及鉀離子刺激下去甲腎上腺素神經(jīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的成像。更重要的是，作者首次實現(xiàn)抗抑郁藥物刺激大鼠大腦去甲腎上腺素水平的實時熒光成像。

前言

隨著社會壓力的增加，抑郁癥狀的患者數(shù)量猛增。抑郁癥已成為全球殘疾的主要原因和全球疾病負(fù)擔(dān)的主要貢獻(xiàn)者。抑郁癥與大腦中去甲腎上腺素(NE)水平的降低密切相關(guān)。去甲腎上腺素是單胺類兒茶酚胺神經(jīng)遞質(zhì)合成的中心物質(zhì)，在苯乙醇胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶(PMNT)的作用下，多巴胺(DA)的酶促反應(yīng)，再產(chǎn)生腎上腺素(EP)。這三種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)相似，都是通過酶反應(yīng)先后合成的。設(shè)計能對去甲腎上腺素產(chǎn)生特異性反應(yīng)的熒光探針是一項極其困難的任務(wù)。傳統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)檢測方法主要依靠電化學(xué)分析和質(zhì)譜分析，但在體內(nèi)原位檢測時往往存在一定的局限性。目前，熒光法檢測和標(biāo)記去甲腎上腺素主要包括以下幾個方面。Kleinfeld團(tuán)隊報告了基于細(xì)胞的神經(jīng)遞質(zhì)熒光報告器；CNiFERs用于神經(jīng)信號傳導(dǎo)過程中NE或DA細(xì)胞外濃度的變化的熒光成像；Sames報告了使用神經(jīng)遞質(zhì)熒光染料FFN270對神經(jīng)信號傳導(dǎo)過程中NE的釋放進(jìn)行成像；Li報道NE和GPCR的特異性結(jié)合被用來調(diào)節(jié)與GPCR連接的cpEGFP脫質(zhì)子過程，釋放增強(qiáng)的單通道熒光信號，實現(xiàn)特異性、高靈敏度以及實時監(jiān)測；Glass小組利用有機(jī)小分子對神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)行熒光檢測。基于去甲腎上腺素特異性反應(yīng)的熒光探針檢測神經(jīng)遞質(zhì)含量和釋放標(biāo)記物仍然是一個挑戰(zhàn)。作者利用花菁作為熒光團(tuán)，延長去甲腎上腺素的發(fā)射波長，引入磺酸鹽，大大提高其水溶性，實現(xiàn)了水溶液中去甲腎上腺素的紅色熒光檢測，并成功標(biāo)記細(xì)胞中的去甲腎上腺素囊泡，對高鉀離子刺激下去甲腎上腺素胞排過程進(jìn)行了成像，實現(xiàn)抗抑郁藥氟西汀誘導(dǎo)體內(nèi)去甲腎上腺素升高的原位成像，對抑郁癥藥物治療的研究和篩選具有一定的現(xiàn)實意義。

結(jié)果與討論

作者在體外研究了探針對去甲腎上腺素的紫外-可見和熒光響應(yīng)。將5 mM NE加入含10 μM探針的2 mL PB (pH 5.0)中。如圖1a所示，體系在675和775 nm處的紫外吸收隨時間逐漸減小，而在550 nm處的紫外吸收則逐漸增加。因此，在加入NE后，體系的熒光強(qiáng)度在640 nm處逐漸增加，是只含探針的體系的14倍(圖1b)。反應(yīng)后體系的光譜性質(zhì)與花菁酮本身的光譜性質(zhì)基本一致。與去甲腎上腺素相比，多巴胺和腎上腺素仍能誘導(dǎo)較少的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)(圖1c)。作者還研究了其他神經(jīng)遞質(zhì)(5 mM)，如5- HT，GABA和氨基酸(500 μM)，如蘇氨酸，絲氨酸，賴氨酸，都沒有引起探針明顯的熒光變化。另外，100 μM半胱氨酸/10 μM同型半胱氨酸與類似的巰基乙胺和5 mM GSH，也沒有誘導(dǎo)顯著的熒光響應(yīng)。本工作大大縮短了探針響應(yīng)時間，在50 min內(nèi)完成反應(yīng)，最大限度地減少了氧化還原對去甲腎上腺素的損失。通過質(zhì)譜證實了探針對去甲腎上腺素的特異性響應(yīng)機(jī)制。

圖1. (a) 10 μM探針對5 mM NE在PB (pH 5.0)中的紫外-可見響應(yīng)0 ~ 120分鐘。(b) 10 μM探針對5 mM NE在PB (pH 5.0)中的熒光響應(yīng)0 ~ 60分鐘(λex= 550 nm)。(c)時間依賴10 μM探針5 mM NE、DA,和EP 0?60分鐘。(d) 10 μM探針在5 mM的選擇性神經(jīng)遞質(zhì) (DA，EP,，NE，5-GABA)、谷胱甘肽,氨基酸500 μM(賴氨酸,蘇氨酸，絲氨酸), 100 μM Cys和10 μM Hcy。去甲腎上腺素響應(yīng)機(jī)理示意圖

作者選擇了幾種細(xì)胞來標(biāo)記內(nèi)源性去甲腎上腺素。當(dāng)20 μM探針與HeLa細(xì)胞和HepG-2細(xì)胞在37°C下培養(yǎng)40 min時，未觀察到明顯的熒光發(fā)射。PC12細(xì)胞可分泌富含去甲腎上腺素的囊泡并有胞吐作用。與PC12細(xì)胞在類似條件下培養(yǎng)后，可以觀察到明顯的紅色熒光發(fā)射，并隨時間的推移而增加(圖2)。該探針可以標(biāo)記囊泡中的去甲腎上腺素去甲腎上腺素排出過程的顯像。

圖2. PC12細(xì)胞、HeLa細(xì)胞和HepG2細(xì)胞經(jīng)20μM探針在紅色通道中培養(yǎng)5 ~ 40分鐘(λ_ex = 561 nm, bar = 20μM)。

高濃度鉀刺激細(xì)胞產(chǎn)生的動作電位導(dǎo)致電壓依賴性鈣離子通道去極化，打開鈣離子通道。在電化學(xué)電位的驅(qū)動下，鈣離子從外部流入細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)中鈣離子濃度的增加觸發(fā)了囊泡與細(xì)胞質(zhì)膜的融合，可以刺激神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。作者用高K⁺溶液刺激孵育探針標(biāo)記的去甲腎上腺素囊泡的PC12細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)的熒光點強(qiáng)度逐漸降低。但在相同條件下，用PBS(不含鉀離子)刺激細(xì)胞，紅色通道的熒光強(qiáng)度幾乎沒有變化(圖3)表明，K⁺濃度增加導(dǎo)致細(xì)胞胞飲，探針實現(xiàn)了去甲腎上腺素信號通路的可視化。

圖3. (a - e)高K⁺(100 μL)的PC12細(xì)胞在紅色通道(0?40 s)， (f - j)含PBS的PC12細(xì)胞在紅色通道(0?40 s)，(K)含PBS的PC12細(xì)胞在0?40 s (λ_ex= 561 nm, bar = 20 μm)。

作為一種長波長的紅色熒光探針，我們將其用于腦組織的標(biāo)記。對TH和DBH或DBH和PNMT進(jìn)行雙重免疫標(biāo)記是一種成功有效的方法。作者首先使用兔抗酪氨酸羥化酶多克隆抗體和抗多巴胺β-羥化酶，隨后使用山羊抗兔IgG/Cy3二抗混合物和山羊抗小鼠IgG/ALexa Fluor 35030分鐘，然后用探針(10 μM)染色120分鐘。對于PNMT和DBH雙標(biāo)記實驗，切片用兔抗PNMT多克隆抗體和抗多巴胺β-羥化酶2 h后，加入山羊抗兔IgG/Cy3二抗混合物(和山羊抗小鼠IgG/ALexa Fluor 350 30分鐘，然后用探針(10 μM)染色120分鐘。如圖4所示，探針(b1, b2)和DBH-AF350 (c1,c2)的熒光發(fā)射區(qū)域有廣泛的重疊(e1, e2)，表明探針對去甲腎上腺素能神經(jīng)元具有特異性的標(biāo)記能力。同時，通過DBH和PNMT的雙重免疫標(biāo)記，仍然顯示探針特異性地標(biāo)記去甲腎上腺素高于腎上腺素(圖5)。這種雙向檢測策略有力地證明了探針能夠在組織水平上有效地、特異性地標(biāo)記去甲腎上腺素。

圖4。(a1, a2) cy3標(biāo)記TH陽性區(qū)域的免疫熒光。(b1, b2)探針標(biāo)記的腦組織。(c1, c2)免疫熒光AF350標(biāo)記DBH陽性區(qū)域。(d1) a1和b1的合并圖像。(d2) a2和b2合并后的圖像。(e1) b1和c1的合并圖像。(e2) b2和c2合并圖像(Cy3:λex= 548 nm。AF350: λex= 405 nm。探針:λex= 561 nm。Bar = 200μm)。

圖5. (a1, a2) cy3標(biāo)記PNMT陽性區(qū)域的免疫熒光。(b1, b2)探針標(biāo)記的腦組織。(c1, c2)免疫熒光AF350標(biāo)記DBH陽性區(qū)域。(d1) a1和b1的合并圖像。(d2) a2和b2合并后的圖像。(e1) b1和c1的合并圖像。(e2) b2和c2合并圖像(Cy3:λex= 548 nm。AF350:λex= 405 nm。探針:λex= 561 nm。Bar = 200μm)。

由于探針的波長較長，成像的穿透深度總是受到波長的限制，有效地補(bǔ)充了熒光成像的局限性，進(jìn)行了活體熒光成像。在小鼠背部右側(cè)注射探針(20 μM)，然后注射去甲腎上腺素200 μM)在同一區(qū)域注入。在小鼠背部另一側(cè)注射20 μM探針和與NE體積相同的PBS。如圖6所示，信號NE組的紅通道隨時間增加而增加，而對照組則無明顯變化。我們認(rèn)為該探針可作為體內(nèi)NE檢測的有效工具，在神經(jīng)遞質(zhì)和信號通路的定量分析方面具有良好的臨床應(yīng)用前景。

氟西汀作為一種選擇性5 -羥色胺再攝取抑制劑，可以增強(qiáng)5 -羥色胺的神經(jīng)傳遞，產(chǎn)生與氟西汀一樣的抗抑郁作用，它還可以增加下丘腦、皮質(zhì)、皮質(zhì)和前額葉皮質(zhì)中的多巴胺和細(xì)胞外去甲腎上腺素水平，作者進(jìn)行了氟西汀干預(yù)下去甲腎上腺素釋放顯像實驗。我們給大鼠腹腔注射氟西汀(10mg /kg)，手術(shù)暴露大腦40 min后，將探針(200 μM)直接注入大腦成像。與老鼠同樣體積的生理鹽水腹腔內(nèi),老鼠用氟西汀治療大腦中去甲腎上腺素水平明顯高于對照組(圖7)，為臨床抗抑郁藥物的篩選和療效評估提供新的研究手段。

圖6. 注射PBS/NE (λex= 561 nm)的小鼠體內(nèi)熒光成像。

圖7. (a?c)腹腔注射生理鹽水的大鼠體內(nèi)成像。(d - f)腹腔注射氟西汀(10 mg/kg)的大鼠體內(nèi)成像。(g)大鼠注射ROIs、生理鹽水和氟西汀的熒光強(qiáng)度(λex= 561 nm)。

結(jié)論

作者采用離開保護(hù)熒光團(tuán)基團(tuán)產(chǎn)生分子內(nèi)PET效應(yīng)，沒有熒光發(fā)射。隨后，利用NE獨特的氨基乙醇結(jié)構(gòu)單元，通過級聯(lián)親核和離開反應(yīng)，發(fā)生脫保護(hù)和熒光團(tuán)釋放。利用長波長紅光熒光探針，我們通過細(xì)胞成像、切片成像和體內(nèi)成像驗證了探針在復(fù)雜生物環(huán)境中對NE的特異性響應(yīng)。作者應(yīng)用該探針對高K⁺刺激下去甲腎上腺素胞飲信號通路進(jìn)行熒光成像，并觀察到抗抑郁藥物對去甲腎上腺素干預(yù)的效果。

參考文獻(xiàn)

Na Zhou, Fangjun Huo, Yongkang Yue, and Caixia Yin*, Specific Fluorescent Probe Based on “Protect?Deprotect” To Visualize the Norepinephrine Signaling Pathway and Drug Intervention Tracers, J. Am. Chem. Soc., J. Am. Chem. Soc. 2020, 142, 17751?17755. DOI: 10.1021/jacs.0c08956. https://pubs-acs-org-s.z.library.sh.cn/doi/10.1021/jacs.0c08956

產(chǎn)品提供

近紅外去甲腎上腺素熒光探針