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熒光蛋白(fluorescent protein)屬于一種可視化的報(bào)告基因編碼蛋白,在一定的波長(zhǎng)下可發(fā)出明亮熒光,它的特點(diǎn)有熒光穩(wěn)定、容易檢測(cè)、對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害、無(wú)需底物和無(wú)物種特異性等。常見(jiàn)的有綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白等。
綠色熒光蛋白(GFP)簡(jiǎn)述及應(yīng)用:
綠色熒光蛋白(GFP)是一個(gè)由約238個(gè)氨基酸組成的具有潛力的標(biāo)記物,分子量約27kDa。熒光基團(tuán)能夠自身催化組成生色團(tuán),通過(guò)紫外光或藍(lán)光激發(fā)時(shí)發(fā)出可見(jiàn)的綠色熒光,熒光性質(zhì)穩(wěn)定、具有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。
GFP的純化:
1、用PCR擴(kuò)增出綠色熒光蛋白(GFP)基因
2、插入到pGEX-KG表達(dá)載體中,并將構(gòu)建出的重組質(zhì)粒命名為pKG- GFP
3、將重組載體導(dǎo)入大腸桿菌DH10β中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)生GST-GFP融合蛋白
紅色熒光蛋白(RFP)簡(jiǎn)述及應(yīng)用
紅色熒光蛋白(RFP)是一種會(huì)發(fā)光的蛋白質(zhì),通過(guò)它可以看到細(xì)胞的活動(dòng),進(jìn)行更深入的研究。RFP異源二聚體是由ddRFPA1蛋白和ddRFPB1蛋白聚合而成。
RFP熒光對(duì)PNGase酶活性檢測(cè):
1、利用定點(diǎn)突變將N-糖基化位點(diǎn)引入ddRFP
2、突變體在大腸桿菌里(無(wú)糖基化系統(tǒng))表達(dá)后獲得紅色熒光二聚體
3、建立酵母表達(dá)系統(tǒng)(有糖基化系統(tǒng))對(duì)蛋白進(jìn)行表達(dá),獲得糖基化蛋白產(chǎn)物
4、將蛋白做體外混合實(shí)驗(yàn),通過(guò)測(cè)定混合物去糖基化后的熒光強(qiáng)度變化檢測(cè)PNGase的活性
【熒光標(biāo)記的組蛋白】:
FITC-Histone
CY3-Histone
CY5-Histone
CY5.5-Histone
CY7-Histone
CY7.5-Histone
ICG-Histone
Nucleohistone-CY5
Nucleohistone-CY3
Nucleohistone-CY5.5
Nucleohistone-CY7.5
Nucleohistone-CY7
Nucleohistone-ICG
Nucleohistone-FITC
綠色熒光蛋白(GFP)簡(jiǎn)述及應(yīng)用:
綠色熒光蛋白(GFP)是一個(gè)由約238個(gè)氨基酸組成的具有潛力的標(biāo)記物,分子量約27kDa。熒光基團(tuán)能夠自身催化組成生色團(tuán),通過(guò)紫外光或藍(lán)光激發(fā)時(shí)發(fā)出可見(jiàn)的綠色熒光,熒光性質(zhì)穩(wěn)定、具有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。
GFP的純化:
1、用PCR擴(kuò)增出綠色熒光蛋白(GFP)基因
2、插入到pGEX-KG表達(dá)載體中,并將構(gòu)建出的重組質(zhì)粒命名為pKG- GFP
3、將重組載體導(dǎo)入大腸桿菌DH10β中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)生GST-GFP融合蛋白
紅色熒光蛋白(RFP)簡(jiǎn)述及應(yīng)用
紅色熒光蛋白(RFP)是一種會(huì)發(fā)光的蛋白質(zhì),通過(guò)它可以看到細(xì)胞的活動(dòng),進(jìn)行更深入的研究。RFP異源二聚體是由ddRFPA1蛋白和ddRFPB1蛋白聚合而成。
RFP熒光對(duì)PNGase酶活性檢測(cè):
1、利用定點(diǎn)突變將N-糖基化位點(diǎn)引入ddRFP
2、突變體在大腸桿菌里(無(wú)糖基化系統(tǒng))表達(dá)后獲得紅色熒光二聚體
3、建立酵母表達(dá)系統(tǒng)(有糖基化系統(tǒng))對(duì)蛋白進(jìn)行表達(dá),獲得糖基化蛋白產(chǎn)物
4、將蛋白做體外混合實(shí)驗(yàn),通過(guò)測(cè)定混合物去糖基化后的熒光強(qiáng)度變化檢測(cè)PNGase的活性
【熒光標(biāo)記的組蛋白】:
FITC-Histone
CY3-Histone
CY5-Histone
CY5.5-Histone
CY7-Histone
CY7.5-Histone
ICG-Histone
【熒光標(biāo)記血紅蛋白】:
Hemoglobin-CY5
Hemoglobin-CY3
Hemoglobin-CY5.5
Hemoglobin-CY7.5
Hemoglobin-CY7
Hemoglobin-FITC
Nucleohistone-CY5
Nucleohistone-CY3
Nucleohistone-CY5.5
Nucleohistone-CY7.5
Nucleohistone-CY7
Nucleohistone-ICG
Nucleohistone-FITC
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