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內(nèi)容提要

近紅外II光譜的熒光成像在組織成像方面具有很大的前景。作者通過在分子和形態(tài)水平上操縱扭曲的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移和聚集誘導(dǎo)發(fā)射效應(yīng)來探索有機(jī)NIR-IIb熒光團(tuán)，研制了一種在NIR-II區(qū)可發(fā)射1600 nm的有機(jī)熒光染料，量子產(chǎn)率為11.5%?；谟袡C(jī)染料對(duì)活鼠血管和深層腸道進(jìn)行NIR-IIb熒光成像，成像清晰度高，信號(hào)背景比增強(qiáng)，本研究能對(duì)有機(jī)NIR-IIb生物成像染料的發(fā)展具有啟發(fā)作用。

前言

在第二近紅外區(qū)域(NIR-II, 1000 – 1700 的熒光成像，由于進(jìn)一步抑制光子散射和最小化的自熒光，使深層生物結(jié)構(gòu)的直接可視化和實(shí)時(shí)反饋比NIR-I (800 - 900nm)更清晰。NIR-IIb (1500-1700 nm)熒光團(tuán)的自熒光幾乎為零，光散射更低，可進(jìn)一步提高成像的時(shí)空分辨率和穿透深度。量子點(diǎn)(QDs)、稀土摻雜納米粒子(RENPs)和單壁碳納米管(SWCNTs)等無機(jī)材料已經(jīng)證明可以提高體內(nèi)血管和**成像的分辨率。有機(jī)材料具有潛在的生物降解性、顯著的生物相容性和易于加工的優(yōu)點(diǎn)，為NIR-IIb成像提供了相當(dāng)大的前景。延長有機(jī)染料的共軛長度是一種被廣泛研究的紅移發(fā)射策略。當(dāng)這些大型π共軛體系以生物有用的聚集態(tài)或納米粒子出現(xiàn)時(shí)，強(qiáng)烈的分子間π-π相互作用往往導(dǎo)致發(fā)射猝滅。利用分子工程電子給體(D)和受體(A)降低有機(jī)熒光團(tuán)的最高已占據(jù)分子軌道(HOMO)和最低未占據(jù)分子軌道(LUMO)的能帶隙是另一種有效的紅移發(fā)射方法。一些具有扭曲D-A結(jié)構(gòu)的熒光團(tuán)表現(xiàn)出激發(fā)態(tài)電子轉(zhuǎn)移過程性質(zhì)，即扭曲分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(TICT)。利用TICT的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)限制其非輻射衰變，可以獲得發(fā)光的有機(jī)熒光團(tuán)，并將其發(fā)射擴(kuò)展到NIR-IIb區(qū)域。在分子水平上，暗TICT態(tài)的形成依賴于D-A單元在分子內(nèi)的靈活旋轉(zhuǎn)，這種運(yùn)動(dòng)有利于各種非輻射途徑產(chǎn)生微弱但長波長的發(fā)射(圖1a)。另一方面，通過限制分子內(nèi)運(yùn)動(dòng)，可以獲得增強(qiáng)的熒光強(qiáng)度。聚集誘導(dǎo)發(fā)射(AIE)可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)具有紅移發(fā)射和高量子產(chǎn)量(QY)的熒光團(tuán)具有巨大的潛力。由于分子內(nèi)運(yùn)動(dòng)(RIM)機(jī)制的限制，AIE發(fā)光原(AIEgens)在聚集時(shí)發(fā)出強(qiáng)烈的光(圖1b)。由于由多個(gè)分子轉(zhuǎn)子裝飾的扭曲結(jié)構(gòu)，即使在聚集狀態(tài)下，AIEgens仍然可以在分子內(nèi)移動(dòng)，這傾向于進(jìn)入暗TICT狀態(tài)。通過分子水平(TICT)和形態(tài)水平(聚集)的結(jié)構(gòu)調(diào)制，可以同時(shí)獲得具有長波發(fā)射和高熒光QY的有機(jī)基納米粒子(圖1c)。作者設(shè)計(jì)了三個(gè)D-A型AIEgens，并將其發(fā)射擴(kuò)展到NIR-IIb區(qū)域。采用強(qiáng)吸電子單元苯并二噻唑(BBTD)作為電子受體，三苯胺(TPA)作為供體和分子轉(zhuǎn)子來表征TICT的性質(zhì)。在BBTD和TPA之間引入烷基噻吩，以保證共軛主鏈有較大的變形。2TT-oC26B的最大發(fā)射波長為~1030 nm，尾部延伸至1600 nm, QY高達(dá)11.5%?；?/span>2TT-oC26B有機(jī)納米顆粒的NIR-IIb區(qū)域的熒光成像具有高分辨率和增強(qiáng)的信號(hào)-背景比(SBR)，可以實(shí)時(shí)清晰地顯示腸道的詳細(xì)結(jié)構(gòu)，為內(nèi)部器官成像提供了一個(gè)強(qiáng)大的平臺(tái)。

結(jié)果與討論

為了構(gòu)建聚集態(tài)NIR-IIb發(fā)光的共軛AIEgens，分子設(shè)計(jì)包括三個(gè)要素：強(qiáng)D-A結(jié)構(gòu)；可旋轉(zhuǎn)的單位；體積龐大的π共軛橋提供了一定的空間阻礙使分子具有扭曲構(gòu)象。作者選擇BBTD作為強(qiáng)電子受體，烷基噻吩作為給體單位和π共軛橋。具有扭曲結(jié)構(gòu)的TPA作為保證TICT狀態(tài)形成的分子轉(zhuǎn)子，同時(shí)作為第二供體單元促進(jìn)電荷轉(zhuǎn)移。烷基鏈的位置和分子轉(zhuǎn)子對(duì)于確定熒光團(tuán)的聚集發(fā)射是至關(guān)重要的。由于扭曲結(jié)構(gòu)阻礙了強(qiáng)烈的分子間相互作用，與鄰位烷基鏈單元(鄰近BBTD)相結(jié)合的TPA分子轉(zhuǎn)子在納米顆粒中顯示出強(qiáng)烈的熒光(典型的AIE)。烷基鏈可以提供納米顆粒分子的空間隔離，促進(jìn)分子內(nèi)運(yùn)動(dòng)，這有利于形成暗TICT態(tài)。為了研究烷基鏈的影響，將直鏈己基(2TToC6B)、支鏈2-乙基己基(2TT-oC26B)和2辛基癸基(2TT-oC610B)接枝到噻吩的鄰位。分子設(shè)計(jì)的關(guān)鍵元素集中于采用第二碳支鏈的烷基鏈，因?yàn)樗鼈兲峁┝丝烧{(diào)的空間位阻，不僅可以防止分子間相互作用，而且可以促進(jìn)分子內(nèi)運(yùn)動(dòng)。與具有線性己基的2TT-oC6B相比，具有支化2-乙基己基的2TT-oC26B的分子內(nèi)運(yùn)動(dòng)具有更大的扭轉(zhuǎn)構(gòu)象，而具有更多受阻的2-辛基癸基的2TToC610B的分子內(nèi)運(yùn)動(dòng)空間最大。如圖1所示，噻吩與BBTD之間的大二面角(~50°)證實(shí)了鄰位烷基鏈的空間效應(yīng)。圖    在分子水平上，這三個(gè)分子在四氫呋喃(THF)溶液中表現(xiàn)出典型的電荷轉(zhuǎn)移(CT)吸收帶，在~700 nm處，而它們的發(fā)射最大值位于NIR-II區(qū)域，為高清晰度的熒光成像提供了平臺(tái)。為了考察這三個(gè)分子在較高形態(tài)(聚集態(tài))下的熒光性質(zhì)，我們記錄了它們?cè)诓煌謹(jǐn)?shù)(fw)的THF/H_{混合物中的光致發(fā)光(PL)光譜。隨著水加入到THF中，2TT-oC26B的發(fā)射強(qiáng)度逐漸降低，直到fw= 40%，伴隨著紅移發(fā)射，表明了TICT特性的顯著溶劑化效應(yīng)(圖3a)。為了支持聚集過程中TICT特性的存在，進(jìn)一步向體系中加水，水的加入量從40%增加到90%}，的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，這是由聚集體形成引發(fā)的RIM機(jī)制所致。在~1030 nm處的長波長峰表明2TT-oC26B聚集體的TICT特性仍然存在。同樣，2TT-oC6B和2TT-oC610B也具有TICT+ AIE特性(圖3b)。因此，主鏈(thiopheneBBTD-thiophene)扭曲和供體(TPA)扭曲的結(jié)合有利于TICT和AIE效應(yīng)的共存，通過操縱分子內(nèi)運(yùn)動(dòng)聚集了長波長發(fā)射(TICT)和強(qiáng)發(fā)射強(qiáng)度(AIE)的優(yōu)勢。為了進(jìn)一步在形態(tài)水平上研究熒光性質(zhì)，作者使用生物相容性兩親共聚物(DSPE-PEG2000)作為摻雜基質(zhì)，通過納米沉淀法將AIEgens制備成納米粒子(AIE NPs)(圖4a)。一方面，由于表面PEG降低了免疫識(shí)別能力，減少了蛋白質(zhì)的吸附，使得AIEgens具有良好的膠體穩(wěn)定性和良好的血液循環(huán)時(shí)間。另一方面，納米粒子觸發(fā)對(duì)分子內(nèi)運(yùn)動(dòng)的調(diào)制，從而產(chǎn)生明亮的長波長發(fā)射。AIE NPs在NIR-II區(qū)域表現(xiàn)出發(fā)射，與它們的溶液態(tài)分布相似。它們的發(fā)射光譜甚至擴(kuò)展到1600 nm(圖3c)，能夠進(jìn)行NIR成像。這些AIE NPs的QY測定為11.5%，，。整個(gè)NIR-II地區(qū)(1000 - 1600 nm) 2 和2分別以IR-26為參考(圖3d)；而NIR-IIb區(qū)域(1500-1600 nm)的QY分別為0.12%、0.11%和0.09%。這些AIE NPs的吸收最大值位于730 nm，對(duì)深層組織激發(fā)和避免沒有光損傷 (圖3 e)。最重要的是，這些AIE NPs在連續(xù)激光照射下表現(xiàn)出良好的光穩(wěn)定性(圖3f)。這些結(jié)果支持這些AIE NPs可以用于NIR-IIb熒光成像。

圖3。 在THF/水混合物中具有不同水組分(fw)的PL光譜。的三個(gè)分子的PL強(qiáng)度(I/I0)變化，其中I和I_{的PL強(qiáng)度最大。納米粒子的PL光譜。插圖:放大發(fā)射光譜在1500-1600 nm。三種化合物納米顆粒(1000-1600 nm)和IR26 (1050-1500 nm, QY=0.5%)在五種不同濃度下的熒光光譜圖。納米粒子的吸收光譜。連續(xù)輻照(110mw /cm^{下的吸收強(qiáng)度(A/A}圖，其中A和A分別為激光輻照前和后的最大吸收強(qiáng)度。}

    受2TT-oC26B NIR-IIb區(qū)域紅光和更高QY的啟發(fā)，評(píng)估了其NIR-IIb的體外成像能力。動(dòng)態(tài)光散射(DLS)和透射電子顯微鏡(TEM)測量得到的2TT-oC26B NPs的直徑在60 nm左右，具有良好的水分散性和均勻的球狀結(jié)構(gòu)(圖4b, c)。使用三種不同的長通濾波器(1100、1200和1500 nm)記錄了不同濃度(0.1、0.2、0.5 mg/mL)的2TT-oC26B NPs圖像(圖4e)。當(dāng)用793 nm激光激發(fā)時(shí)，NPs在這三個(gè)窗口顯示出明亮的熒光。雖然在1500-1600 nm區(qū)域的QY僅為0.12%，但在NIR-IIb窗口可以觀察到強(qiáng)發(fā)射。為了進(jìn)一步比較2TT-oC26B NPs在不同近紅外窗口的生物成像能力，將充滿2TToC26B NPs的毛細(xì)管浸泡在1%的脂質(zhì)溶液中，在尖狀的phantom深度。即使在6 浸沒深度下，在NIR-IIb區(qū)域也能分辨出清晰的管邊界，但在NIR-I區(qū)域管邊界模糊不可見。盡管由于QY最高，最亮的圖像記錄在NIR-II區(qū)域，基于幾乎為零的自熒光和更低的光子散射的優(yōu)勢，其SBR(1.8)和半峰寬的分辨率顯著低于NIR-IIb (SBR= 3.1和FWHM= 0.32 cm)。這些數(shù)據(jù)表明，2TT-oC26B NPs適用于NIR-IIb熒光成像。

圖為初始直徑。    熒光血管造影是一種將熒光探針注入血液的醫(yī)學(xué)策略，對(duì)循環(huán)系統(tǒng)和疾病診斷具有重要意義。為了進(jìn)一步研究NIR成像的優(yōu)勢，作者將2TT-oC26B NPs靜脈注射到小鼠血流中，使用不同LP濾光片(1100、1200和1500 nm)的InGaAs相機(jī)記錄其血管造影。靜脈注射2TT-oC26B NPs 10 min后，小鼠的整個(gè)血管網(wǎng)絡(luò)清晰可見(圖5)。與傳統(tǒng)的NIR-II成像(1100和1200 nm LP濾波器)相比，NIR-IIb成像在近似透明的背景下顯示出更高的分辨率(圖5a-c)。類似毛細(xì)血管的橫斷面強(qiáng)度(紅色圓圈)被繪制出來比較SBR。1500 nm LP的NIR-IIb窗的SBR為2.0，高于1200 nm LP的1.2和1100 nm LP的1.1，顯示了NIR-IIb成像的優(yōu)勢。通過對(duì)所選區(qū)域的半寬測量，1100、1200和1500 nm LP的相似血管圖像的表觀寬度分別為0.58、0.56和0.41 mm(圖5d-f)，表明NIR-IIb成像具有最高的空間分辨率。特別是靠近肝臟的血管，1100和1200 nm LP不能清晰地看到，而1500 nm LP可以清晰地看到。高分辨率和低本底干擾為早期疾病提供更準(zhǔn)確的診斷信息。

圖。   在Balb/c裸鼠體內(nèi)靜脈注射2TT-oC26B NPs，進(jìn)一步勾畫完整頭皮和顱骨的腦血管系統(tǒng)。清晰觀察到腦血管，分辨率~71.6μm(圖6a-c)。為了準(zhǔn)確檢測精細(xì)的血管結(jié)構(gòu)，作者還對(duì)大腦進(jìn)行了高倍透顱顯微血管成像。如圖6d-f所示，可以明顯地看到小血管的表觀寬度只有10μm。這種高分辨率是由有機(jī)分子在NIR-IIb區(qū)域的低倍和高倍成像中實(shí)現(xiàn)的。2TT-oC26B NPs由于自身熒光顯著減少和光子散射最小化，表現(xiàn)出了高分辨率和高SBR的高性能NIR-IIb血管造影，在體內(nèi)成像方面顯示出巨大的優(yōu)勢。熒光成像的局限性之一是穿透深度，因此難以透視身體來監(jiān)測胃腸道(GI)等內(nèi)部軟組織，胃腸道疾病與糖尿病、甲狀腺疾病、結(jié)直腸癌等多種疾病相關(guān)。雖然磁共振成像(MRI)和計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)已被廣泛用于臨床診斷腸道疾病6，但有限的空間分辨率、較長的成像時(shí)間和有害的輻射風(fēng)險(xiǎn)限制了對(duì)腸道功能的監(jiān)測。NIR-IIb成像由于其優(yōu)越的時(shí)空分辨率，為實(shí)時(shí)監(jiān)測腸道功能提供了平臺(tái)。因此，在口服2TT-oC26B NPs  后的不同時(shí)間點(diǎn)，使用不同的LP濾片(1100、1200和1500 nm)對(duì)腸道結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像。如圖7a所示，分別在0.5、3、5、6 h灌胃后可看到回腸、盲腸、結(jié)腸和直腸。在1100 nm和1200 nm LP下均能檢測到組織，但圖像模糊，分辨率低。相比之下，在NIR-IIb區(qū)域，使用1500 nm的LP濾波器可以在背景可忽略的情況下區(qū)分清晰的組織特征分辨率。即使是腸道深處坐落在~ 5毫米深度,個(gè)人小腸憩室(~ 1毫米)也明顯歧視(圖7)。長波長成像的空間分辨率增強(qiáng)腸道的精細(xì)結(jié)構(gòu),顯著提高SBR(圖7 b, c)。同時(shí)，盲腸結(jié)構(gòu)也可以在1500 nm LP減少曝光時(shí)間下清晰勾畫出來。在成像過程中可以清楚地監(jiān)測腸的收縮功能。即使我們以大鼠為模型，其腸結(jié)構(gòu)在約8 mm深度的NIR-IIb區(qū)域可以觀察到高清晰度的腸結(jié)構(gòu)，而在NIR-I和NIR-II區(qū)域則很難區(qū)分。利用有機(jī)NIR-IIb探針可以在如此高的分辨率下監(jiān)測小鼠和大鼠的微妙腸道結(jié)構(gòu)。最后，在灌胃24 h后，2TT-oC26B NPs全部以糞便形式從體內(nèi)排出，而不經(jīng)腸道進(jìn)入體內(nèi)，有利于口服GI診斷造影劑的研制。因此，2TT-oC26B NPs可能是評(píng)估深層組織疾病的一個(gè)強(qiáng)大平臺(tái)。

圖沿

結(jié)論

作者展示了使用TICT和AIE聯(lián)合策略的純有機(jī)納米顆粒用于高質(zhì)量的NIR-IIb熒光成像。分子設(shè)計(jì)的關(guān)鍵因素是骨干扭曲與扭曲分子轉(zhuǎn)子的結(jié)合，以調(diào)節(jié)聚集的分子運(yùn)動(dòng)和防止有害的分子間相互作用。在分子水平上，扭曲的NIR-IIb發(fā)射體更有利于分子內(nèi)運(yùn)動(dòng)，從而形成TICT態(tài)。在形態(tài)水平上，分子聚集部分地限制了分子內(nèi)運(yùn)動(dòng)，從而提高了熒光效率。由于具有多個(gè)轉(zhuǎn)子的扭曲三維結(jié)構(gòu)，即使在聚集狀態(tài)下，AIEgens仍然保持分子內(nèi)移動(dòng)。因此，通過分子水平(TICT)和形態(tài)水平(聚集)的結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)，有機(jī)NIR-II 納米顆粒同時(shí)具有紅移發(fā)射和高熒光QY。合成的2TT-oC26B NPs的發(fā)射光譜延伸至1600 nm，整個(gè)NIR-II (1000-1600 nm) QY為11.5%，NIR-IIb (1500-1600 nm) QY為0.12%，為NIR-IIb血管和腸道的高質(zhì)量熒光成像提供了平臺(tái)，對(duì)進(jìn)一步開發(fā)具有超長發(fā)射波長和高亮度的有機(jī)分子具有啟發(fā)作用。

參考文獻(xiàn)

Design of AIEgens for near-infrared IIb imaging through structural modulation at molecular and morphological levels,Yuanyuan Li, Zhaochong Cai, Shunjie Liu, Haoke Zhang, Sherman T.H. Wong, Jacky W.Y. Lam, Ryan T.K. Kwok, Jun Qian*,Ben Zhong Tang*, Nat. Commun., 2020, 11, 1255. DOI: 10.1038/s41467-020-15095-1.https://www.nature.com/articles/s41467-020-15095-1

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