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內容提要

NIR-II熒光成像大大降低了幾乎所有組織類型在長波長下的散射系數，有利于深層組織成像。但是，大多數NIR-II熒光團都存在量子產率低和/或循環時間短的問題，這限制了NIR-II成像的質量。本文通過超分子組裝設計了一種具有強NIR-II熒光發射的蛋白質/花菁復合物，在延長循環時間的情況下， NIR-II量子產率達到21.2%。計算模型揭示了熒光增強的機理，確定了控制近紅外-II熒光團白蛋白復合物的關鍵參數，提供了高分辨率的微血管成像，成像窗口長達3小時。此外，絡合策略被應用于抗體衍生的組件，提供高對比度的**成像，而不影響抗體的靶向能力。本研究為制備高性能的近紅外Ⅱ類熒光團提供了一種簡便的策略，即通過功能蛋白對菁染料進行配伍，從而獲得高性能的NIR-II熒光團。

前言

近紅外(NIR)熒光成像因其在術中成像的適用性而在醫學界獲得了廣泛的應用。這種非侵入性成像方式，鑒于它的范圍是700到1000 nm也被稱為NIR-I成像。因為熒光團可以被組織穿透的近紅外光重復激發，因此具有很高的靈敏度。與目前分子成像的臨床標準-放射性核素核成像技術相比，它具有更好的優勢。此外，低毒成像探針允許隨時間延長成像和/或重復掃描。此外，熒光發射的對比度使周圍組織的目標組織清晰可見。這項技術有可能與其他成像方式(如光聲成像、超聲成像、磁共振成像和正電子發射斷層成像)相結合，以實現多模式成像平臺。近紅外成像應用包括血管造影、**和轉移灶以及淋巴管成像。到目前為止，僅僅吲哚青綠(ICG)和亞甲基藍，被美國食品和藥物管理局(FDA)批準用于人體研究。ICG在臨床上用于心血管功能檢測和視網膜血管造影，但仍然存在光子衰減大、組織自發熒光和光散射等缺點。從1000到1700 nm的NIR-II成像為這些限制提供了一個有前途的解決方案。與NIR-I成像相比，這種成像方式提供了更大的穿透力和對比度。由無機納米顆粒和碳納米管衍生的近紅外II熒光團顯示出生物相容性和安全性問題；其他典型的NIR-II熒光團如供體-受體-供體(D-A-D)染料，量子產率很低。雖然延長多亞胺結構的共軛結構產生了有效的NIR-II熒光團，但很少有水溶性或生物相容性的熒光團。因此，NIR-II成像臨床轉化的主要障礙是滿足亮度和生物相容性要求的熒光團數量有限。花菁染料的發射光譜橫跨整個NIR-I區域，發射尾部延伸到NIR-II窗口，因此，NIR-I探針可以被重新用于NIR-II生物成像，從而加速了這種成像方式向臨床轉化的過程。除了提供高對比度的**和血管成像，這些染料還表現出快速的肝膽清除。與無機納米探針相比，減少了與生物相容性和安全性相關的問題。然而，由于循環時間短，這些染料為血管成像提供了不到2min的成像窗口。這些染料與蛋白質的生物結合可以延長循環時間，盡管這可能會因為猝滅效應而以亮度為代價。開發一種具有高QY和改善藥代動力學特征的明亮的NIR-II熒光團仍然是一個挑戰。

本研究調查了花菁染料與牛血清白蛋白(BSA)的組裝是否會增加循環時間、量子產率、穩定性和成像對比度。通過實驗和計算模擬，我們確定了一種自組裝的IR-783@BSA，具有很高的穩定性和熒光強度，適合于高對比度成像。IR-783@BSA的循環時間延長，可在注射后3小時以超高對比度顯示小于3μm寬的血管。IR-783與白蛋白之間的納米分子結合親和力促進了扭曲的分子內電荷轉移(TICT)過程和NIR-II量子效率的提高。通過設計白蛋白和菁染料之間的超分子組裝，該配合物可以保持扭曲的構象，從而能夠提高TICT過程和循環時間。我們進一步證明，這種方法可以擴展到單克隆抗體(Erbitux)，以賦予分子靶向性。這項研究提供了一種簡便的策略，通過用功能蛋白修飾菁染料來生產高性能的NIR-II熒光團，這在臨床上顯示出很高的潛力。

結果與討論

通過超分子相互作用將菁染料與牛血清白蛋白組裝在一起，以創建穩定的牛血清白蛋白包裹熒光團的復合物。首先評估了三種候選染料IR-783、IR-12N3和ICG (IR-12N3在BSA緩沖液中的相對QY是ICG的2.8倍)。我們研究了菁染料與BSA的相互作用，并測定了與解離常數Kd=1 nM的很強的結合親和力。IR-783的相對近紅外光譜QY與IR-12N3相近。在牛血清白蛋白存在的情況下，通過將每種染料加熱到室溫到90°C的溫度來測試熒光團的溫度依賴性。在60°C附近的溫度下，熒光強度增加了大約6倍。由于菁染料的TICT，IR-783也顯示出明亮的NIR-II尾部發射，啟發我們優化所制備的復合物的NIR-II發射用于深度組織成像。我們使用四種合成策略制備復合物。第一個條件(C1)是將染料與牛血清白蛋白(BSA)自由混合，加熱10 min形成復合物。第二種(C2)包括谷胱甘肽(GSH)和10分鐘的加熱，GSH促進二硫鍵的可逆斷裂以捕獲熒光團。第三組(C3)加入谷胱甘肽和戊二醛(GTD)，戊二醛是一種伯胺交聯劑，加熱10分鐘。第四個(C4)指的是GTD和10分鐘加熱的組合。在優化熒光團與牛血清白蛋白(BSA)復合物的形成條件之前，我們利用FBS/PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)緩沖法建立了一個比值，通過監測熒光強度來測試該復合物的穩定性。所有被測熒光團在FBS中的熒光強度都高于在BSA中的熒光強度；因此，FBS/PBS中熒光團的熒光比最接近1表明與BSA籠的穩定性最高。我們測量了由上述四種方法(C1至C4)得到的三種熒光團@BSA配合物的熒光強度、大小和穩定性。IR-783@BSA復合物比IR-12N3@BSA和ICG@BSA復合物更穩定。此外，IR-783@BSA配合物在60°C加熱后QY最高，熒光增強明顯高于另外兩個熒光團@BSA配合物。因此，我們選擇IR-783@BSA進行進一步優化。優化程序包括優化染料和白蛋白的比例和濃度，混合后的預孵育時間，孵育后10分鐘的加熱溫度(從室溫到70°C)，以及優化穩定性和尺寸，以獲得良好的熒光強度和體內藥代動力學性能。我們首先優化了IR-783在自由混合(C1)和谷胱甘肽(C2)條件下的濃度依賴性，證實了BSA：IR-783的比例高達1：1，并具有優化的性質，如尺寸、熒光強度和絡合物穩定性。反應體系的濃度控制在20 mg/mL以下，以避免聚集和過度交聯。通過測量復合物在不同孵育時間點的穩定性和大小，將預孵育時間優化為24小時。為了進一步優化穩定性和發射亮度，在四種方法中的每一種都測試了三種不同比例的BSA：IR-783。我們觀察到，當BSA：染料的比例為1：0.5和1：1時，復合物最穩定，而當比例為1：2時，復合物變得不穩定。在GSH(C2)和GSH+GTD(C3)條件下，復合物的平均粒徑為~60 nm，而在自由混合(C1)和GTD(C4)條件下，復合物的平均粒徑小于20 nm，表明GSH方法導致了分子間交聯。透射電子顯微鏡、原子力顯微鏡和電泳分析也表明，與C1和C4相比，C2和C3產生了更大尺寸的復合物。從電泳分析中，我們觀察到納米復合物的單體、二聚體、三聚體和其他多聚體。因此，需要密度梯度離心法(DGU)純化以將復合物從較小的物種中分離出來，以獲得尺寸均勻的復合物。此外，10分鐘的加熱溫度對于形成穩定的復合物也很重要，表明60℃和70℃滿足了定制大復合物的需要，更高的溫度可以產生更多的大納米復合物。

圖1。(A) 牛血清白蛋白包裹熒光團復合物形成示意圖。(B) 用Kd值為1 nM的生物膜干涉法測定IR-783與白蛋白的動力學結合。(C) 預混牛血清白蛋白的染料加熱10min后白度增強。(D) IR-783在牛血清白蛋白溶液中的吸收、近紅外-I和近紅外-II發射。(E) 60℃時，熒光團(IR-783、IR-12N3和ICG)與牛血清白蛋白(1：1比)的熒光增強。(F) IR-783@BSA復合物(C1~C4是在60°C后處理10min合成的)的電泳分析。(G) IR-783@BSA復合物的電泳凝膠分析。

本文通過對接建模研究IR-783和白蛋白之間的姿勢和相互作用。IR-783的結合位點被鑒定為白蛋白的裂隙。雖然IR-783和ICG都被分配到相似的白蛋白結合位點，但ICG顯示出更高的自組裝傾向。自組裝行為的偏離反映了染料分子自組裝和染料與白蛋白相互作用這兩個相互競爭的反應之間的不同趨勢。我們去除了二硫鍵來模擬GSH處理后的部分變性白蛋白。通過平衡模擬得到了與IR-783進一步對接的最佳構象。產生的結合姿勢在IR-783和白蛋白的Trp214之間顯示出非常強的π-π堆積。色氨酸(Trp)是白蛋白中所有氨基酸殘基中最大的結合系統。當共軛體系較大時，特別是當分子與附近的分子有π-π相互作用時，最高占據分子軌道-最低空分子軌道(HOMO-LUMO)間隙通常較小。它們面對的芳香環之間的距離被預測為3.761?，這表明強電子耦合的距離非常短。IR-783和Trp214之間的強相互作用保持了IR-783的扭曲構象，使得TICT過程和NIR-II QY得以增強。增強的TICT過程進一步得到了在LC-BLYP*/6-31G(d)水平上的含時間密度泛函理論(TDDFT)計算的支持。圖2F和圖S5(G和H)中繪制了相應的靜電勢(ESP)表面的HOMO、LUMO和MAP圖。對于NIR-I發射過程，計算的熒光波長為775 nm，與實驗測量值800 nm一致。HOMO和LUMO均沿整個分子骨架分布，表明存在較強的π-π*局域激發發射。根據IR-783與白蛋白之間最佳結合姿勢的對接建模，吲哚部分(二面角為90°)的旋轉產生了一個不對稱的π-共軛主鏈，導致電荷重新分布，進而誘導了TICT。計算的熒光波長增加到~1433 nm，這與我們研究中觀察到的NIR-II發射相對應(從1000 nm增加到1500 nm)。由于IR-783和Trp214之間的距離很短(<4 ?)，我們將系統擴展到由IR-783和Trp214白蛋白組成的簇，使用相同的計算激發能的方法來理解IR-783@BSA情況下的高QY。計算結果表明，垂直激發包括從HOMO-1到LUMO的躍遷，其中HOMO-1幾乎位于Trp214的吲哚環上，而LUMO位于IR-783相對于Trp214的近半側。發射對應于從LUMO到HOMO的轉變，在那里HOMO位于IR-783相對于Trp214的較遠側。在最終發射之前，將發生從HOMO(IR-783)到HOMO-1(Trp214)的電子躍遷。HOMO和HOMO-1中心之間的距離約為12 ?。由于QY與壽命成正比，與躍遷速率成反比，HOMO和HOMO-1之間的長距離解釋了實驗中IR-783@BSA的高QY。

圖2。（A） IR -783@白蛋白復合物的對接建模。（B） IR-783和白蛋白之間的結合殘基和活性口袋的細節。（C和D）IR-783和ICG的分子間堆疊。（E） IR-783和白蛋白與部分二硫鍵裂解的對接建模。（F） TICT誘導的IR-783的NIR-I和NIR-II狀態轉換的示意圖。（G） LUMO（頂部），HOMO（中部）和HOMO-1（底部）是參與吸收（HOMO-1→LUMO）和發射（LUMO→HOMO）過程的三個主要分子軌道。（H） 吸收和發射形成三個步驟的循環。

我們使用優化的IR-783@BSA復合體進行了高對比度實時NIR-II血管成像。記錄的小鼠后肢血管的NIR-II視頻在1300納米的亞NIR-II窗口上產生了超對比度血管成像。主成分分析(PCA)被應用于實時視頻成像，以區分靜脈和動脈血管，受益于最大SBR和灌注周期。在NIR-II動態成像中，在選定的5條血管上繪制感興趣區(ROI)，時間為30min。在ROI的基礎上，繪制的五個ROI的SBR值從1.3到7.6。我們進一步評估了IR-783@BSA復合物的高亮度提供發光二極管(LED)激發的NIR-II成像的能力。與785 nm激光激發成像相比，清晰的后肢成像記錄在1300 nm以上，血管與肌肉信號比相等。與游離菁染料相比，延長IR-783@BSA復合物的設計提供了令人印象深刻的血管分辨率和更長的時間窗口。超亮IR-783@BSA復合體具有將NIR-II成像轉化為臨床應用的巨大潛力。

圖3。(A) 記錄的小鼠后肢血管在幾個時間點的NIR-II視頻。(B) 實時視頻圖像的PCA分析區分了靜脈和動脈血管，以及小血管和背景。(C) 在(A)的NIR-II視頻成像中對選定的五條血管的熒光強度剖面進行監測。(D) 在P.I.30min時血管與肌肉的信號比率。(E) IR-783@BSA復合體的高亮度可在較寬的NIR-II子窗口下提供低功率LED激發的后肢成像。(F) (E)中后肢的橫截面強度剖面(虛線)。(H) LED激發NIR-II成像系統方案。(I) 與游離IR-783相比，IR-783@BSA復合體的血管循環時間延長。

在注射IR-783@BSA后，與來自NIR-I窗口的圖像相比，在NIR-II窗口中對小鼠大腦的NIR-II顯微成像提供了更清晰的血管輪廓，SBR大約增強了一倍。與活體NIR-II全身(2.5×)圖像相比，剃光頭的小鼠頭部在P.I.<30min時的NIR-II全身圖像。在IR-783@BSA復合物中，NIR-II顯微鏡圖像具有更好的分辨率，照亮了小至3μm的血管。IR-783@BSA復合物和游離IR-783圖像的血管與正常組織比率統計表明，IR-783@BSA復合物在NIR-II顯微鏡方法中顯示出優越的血管成像能力。IR-783@BSA復合物的寬發射還潛在地實現了在NIR-I窗口具有峰值發射的雙光子成像。

圖4。(A) 小鼠腦的離體NIR-II顯微鏡成像。(B) 同一位置的NIR-I和NIR-II圖像的橫截面強度分布。(C) IR-783@BSA復合物作用于1300 nm和1200 nm長通濾光片后，分別進行了活體NIR-II全身(2.5×)、血管構型和離體顯微鏡成像。(D) IR-783@BSA復合體和自由IR-783圖像的橫截面強度分布。(E) IR-783@BS復合體和游離IR-783圖像的血管與正常組織比率。

NIR-II窗口的分子成像具有顯著的SBR比率和深層組織穿透性，可以提供癌癥標記物表達的更全面的視圖，以指導治療。在IR-783@BSA復合物研究成果的推動下，我們開發了一種IR-783@Erbitux復合物，用于近紅外II分子靶向成像。抗體和染料的復合物可以在NIR-II窗口中提供靶向成像。我們測試了IR-783@Erbitux復合物與陽性鱗狀細胞癌細胞(SCC)和陰性U87細胞裂解物的靶向能力，表明在60°C的篩選反應條件下，表現出高熒光亮度，而不損失Erbitux對其受體的高靶向親和力。IR-783@Erbitux復合物與先前IR-FGP@Erbitux共軛物的比較表明，IR-783@Erbitux復合物與IR-FGP@Erbitux共軛物相比具有更好的SBR，主要是因為IR-783的亮度增加。用IR-783@Erbitux染色的SCC細胞描述了基于抗體的復合物的持續靶向能力。尾靜脈注射IR-783@Erbitux復合物和游離IR-783后，SCC荷瘤小鼠的體內NIR-II成像顯示了開發的IR-783@Erbitux具有強大的靶向能力。24小時后，IR-783@Erbitux的NIR-II**信號比游離IR-783高2~3倍。盡管肝臟攝取率高于基于白蛋白的復合物，成像質量還不夠高，IR-783@Erbitux仍有望實現簡便的分子成像平臺。這種絡合有可能擴展到嵌入熒光團的功能性生物超分子，使其具有優異的成像能力的多功能。

圖5。(A) IR-783@Erbitux復合物在陽性SCC細胞和陰性U87細胞上的細胞分析(裂解物)試驗。(B) IR-783@Erbitux的鱗狀細胞染色描述了基于抗體的復合物的保留靶向能力。(C) 尾靜脈注射IR-783@Erbitux復合物，對荷鱗狀細胞癌小鼠進行體內NIR-II成像。(D) 在與IR-783@Erbitux病例相同的成像條件下，尾靜脈注射游離IR-783對一只SCC荷瘤小鼠進行體內NIR-II成像。(E) IR-783@Erbitux和游離IR-783在增加時間點P.I.的NIR-II**信號。(F) IR-783@Erbitux復合物在168小時時間點P.I.的體外生物分布。

結論

本文通過系統地剪裁花菁染料與血清白蛋白的超分子組裝，確定了一種性能優越的復合物，具有更長的循環時間和優異的相對QY，揭示了牛血清白蛋白衍生的絡合物與菁染料結合的機理，為改善菁染料的藥代動力學提供了支持。通過應用GSH、GTD和熱的組合獲得了尺寸小于100 nm的自組裝IR-783@BSA復合物，具有高穩定性和高熒光強度，使高對比度血管成像能夠在~3小時的成像窗口內進行，并應用于抗體系統，通過IR-783@Erbitux復合物促進表皮生長因子受體靶向成像，從而實現了體外顯微鏡下的血管成像，以及體內全身成像，照亮了小至3μm的血管。該平臺有可能擴展到其他分子靶點進行個性化治療。

參考文獻

Albumin-Chaperoned Cyanine Dye Yields Superbright NIR-II Fluorophore with Enhanced Pharmacokinetics, Rui Tian*, Qiao Zeng*, Shoujun Zhu, Joseph Lau, Swati Chandra, Robert Ertsey, Kenneth S. Hettie, Tarn Teraphongphom, Zhubin Hu, Gang Niu, Dale O. Kiesewetter, 

Haitao Sun, Xiaodong Zhang, Alexander L. Antaris, Bernard R. Brooks, Xiaoyuan Chen, Sci. Adv. 2019; 5: eaaw0672. DOI: 10.1126/sciadv.aaw0672. https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.aaw0672

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