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內(nèi)容提要

準(zhǔn)確的術(shù)中組織識(shí)別是**手術(shù)的關(guān)鍵，但傳統(tǒng)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，大大延遲了術(shù)中決策的時(shí)間。本文提出了一種基質(zhì)金屬蛋白酶MMP14激活NIR-II納米探針(A&MMP@Ag₂S-AF7P)用于快速無(wú)擾動(dòng)組織分析進(jìn)行體外和體內(nèi)神經(jīng)母細(xì)胞瘤診斷。A&MMP@Ag₂S-AF7P在正常組織中熒光微弱，通過(guò)抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤中過(guò)表達(dá)的MMP-14介導(dǎo)的Ag₂S量子點(diǎn)與A1094之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)而迅速激活，膜穿透肽R9 (TAT 肽)可以使納米探針在癌細(xì)胞中有效內(nèi)化，提供更高的**-正常(T/N)組織比。病變的即時(shí)判別和**邊緣的確認(rèn)使納米探針成為適合癌癥手術(shù)或組織活檢程序的快速診斷試劑。

前言

手術(shù)切除是目前大多數(shù)實(shí)體瘤最主要和最有效的治療方法。術(shù)中冰凍切片組織病理學(xué)中的HE染色作為金標(biāo)準(zhǔn)，已成為手術(shù)中不可或缺的一部分，在很大程度上決定了進(jìn)一步手術(shù)方案的方向。分子檢測(cè)技術(shù)為癌癥特異性生物標(biāo)記物的臨床決策提供了巨大的前景，從而提高癌癥的檢測(cè)和診斷。其中，熒光分子成像具有實(shí)時(shí)、高靈敏度、高特異性、無(wú)電離輻射等特點(diǎn)，被認(rèn)為是術(shù)中組織病理學(xué)診斷的優(yōu)先選擇，特別是近紅外II熒光(NIR-II, 1000 – 1700 nm)成像技術(shù)顯著提高了組織穿透性、空間分辨率和可忽略的自體熒光，使疾病檢測(cè)具有更高的精度和靈敏度。兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤(Children neuroblastoma, NB)是兒童最常見的顱外實(shí)體瘤，在手術(shù)過(guò)程中如何快速判斷組織的惡性和良性仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。MMP14是一種細(xì)胞膜錨定酶，在兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤中過(guò)度表達(dá)。因此，結(jié)合NIR-II熒光成像的獨(dú)特光學(xué)特性和MMP14生物標(biāo)志物的高度特異性的優(yōu)勢(shì)，有望提供一種快速、準(zhǔn)確的診斷方法，協(xié)助術(shù)中決策。作者開發(fā)了一種可激活的NIR-II熒光納米探A&MMP@Ag₂S-AF7P快速術(shù)中病理診斷NB。AF7P是一種靶向MMP14膜型(MT)環(huán)結(jié)構(gòu)域的親和肽，作為NB的靶向配體; MMP14活化肽(MMP)通過(guò)靜電相互作用將聚陽(yáng)離子型細(xì)胞穿透肽R9 (TAT-peptide)和聚陰離子型細(xì)胞穿透肽直接組裝在納米探針表面片段(E8)；由NIR-II發(fā)射的Ag₂S量子點(diǎn)和NIR吸收體A1094組成的FRET系統(tǒng)可以有效阻斷熒光發(fā)射。這種納米探針可應(yīng)用于臨床標(biāo)本的快速染色或噴涂，還可以通過(guò)局部給藥在體內(nèi)檢測(cè)**。病變的即時(shí)確認(rèn)和**邊緣的明確使納米探針足夠作為新的診斷試劑納入癌癥手術(shù)或組織活檢程序。

圖1。A) A&MMP@Ag₂S-AF7P檢測(cè)NB示意圖。B) A&MMP@Ag₂S-AF7P的TEM。C) 各種納米顆粒的水動(dòng)力直徑。D) Ag₂S、Ag₂S- AF7P和A&MMP@Ag₂S-AF7P的吸光度和熒光光譜。

靶向可激活納米探針A&MMP@Ag₂S-AF7P的制備主要包括三個(gè)步驟，分別是Ag₂S量子點(diǎn)的合成、MMP 14活性肽的制備(MMP@Ag₂S-AF7P)、A&MMP@Ag₂S-AF7P的構(gòu)建。A&MMP@Ag₂S-AF7P的TEM如圖1b所示，在水溶液中表現(xiàn)出良好的分散性，平均粒徑為160 nm。如圖1 C所示，經(jīng)過(guò)后續(xù)的表面改性，各種納米顆粒的水動(dòng)力直徑從80 nm到270 nm。Zeta電位測(cè)量結(jié)果顯示，Ag₂S、Ag₂S-AF7P、MMP@Ag₂S-AF7P和A&MMP@Ag₂S-AF7P的表面電荷存在明顯差異。該納米探針在1094 nm處表現(xiàn)出強(qiáng)烈的吸收，由于有效的FRET效應(yīng)，NIR-II窗口的熒光信號(hào)很弱。當(dāng)A1094/Ag₂S的摩爾比為120:1時(shí)，淬火效率達(dá)到78%(圖1 D)。

本研究的癌細(xì)胞檢測(cè)原理是基于MMP14介導(dǎo)的熒光激活。高效和特異的酶活性被認(rèn)為是A&MMP@Ag₂S-AF7P實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)癌細(xì)胞的必要條件。作者通過(guò)記錄A&MMP@Ag₂S-AF7P在生理-上對(duì)各種主要生理離子和分子的反應(yīng)來(lái)檢測(cè)其選擇性。如圖2所示，在A&MMP@Ag₂S-AF7P溶液中加入特定的MMP14酶，激發(fā)了納米探針的快速熒光恢復(fù)，熒光強(qiáng)度的定量分析顯示增強(qiáng)了近5倍。MMP14的酶活性受到其抑制劑GM6001的抑制，納米探針的熒光回收率明顯受到抑制(圖2B)。這些數(shù)據(jù)都表明A&MMP@Ag₂S-AF7P納米探針對(duì)MMP14的高特異性。采用實(shí)時(shí)熒光光譜分析方法監(jiān)測(cè)了MMP14活化A&MMP@Ag₂S-AF7P熒光的動(dòng)態(tài)過(guò)程。加入MMP14后，觀察到NIR- II熒光信號(hào)穩(wěn)定增加，同時(shí)近紅外吸收體A1094快速釋放(圖2C，D)。96%的納米探針可在45 min內(nèi)發(fā)光，表明其快速高效的酶響應(yīng)。沒(méi)有MMP14的對(duì)照組表現(xiàn)出較弱的NIR-II熒光信號(hào)。以上結(jié)果表明，A&MMP@Ag₂S-AF7P可被MMP14快速而特異地激活。

圖2。A) A&MMP@Ag₂S-AF7P對(duì)不同分析物的選擇性; B) Ag₂S QDs在(A) 1050 nm范圍內(nèi)的熒光強(qiáng)度。C) 酶介導(dǎo)的熒光恢復(fù)和D) A1094釋放動(dòng)力學(xué)。

為了檢驗(yàn)A&MMP@Ag₂S-AF7P快速術(shù)中組織學(xué)診斷的能力，作者測(cè)試了納米探針的性能，以分析從動(dòng)物模型和臨床標(biāo)本中獲得的組織樣本(圖3a)。首先，從KP-N-NS荷瘤小鼠中切除的新鮮**組織切成1 mm厚，使用A&MMP@Ag₂S-AF7P通過(guò)簡(jiǎn)單的一步染色進(jìn)行組織分析。30分鐘后，寬帶多路顯微鏡熒光顯微成像顯示組織的某些區(qū)域有強(qiáng)烈的NIR-II熒光信號(hào)，如圖3 B所示，與DAPI細(xì)胞核染色很好地匹配。隨后，對(duì)同樣的**組織進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)HE染色，**區(qū)域的精確共定位證實(shí)了A&MMP@Ag₂S-AF7P對(duì)**的精確檢測(cè)能力(圖3 B)，驗(yàn)證了A&MMP@Ag₂S-AF7P納米探針在精確識(shí)別臨床**組織方面的潛力。如圖3 C、D所示，將NB患者的**組織與A&MMP@Ag₂S-AF7P孵育30分鐘，并進(jìn)一步用DAPI染色。在**組織和轉(zhuǎn)移組織中可見明顯的NIR-II熒光強(qiáng)度。MMP14抑制劑(GM6001)預(yù)孵育的**組織的熒光強(qiáng)度明顯弱于未孵育的**組織。由于T/N高于正常的組織比(T/N=7.6)，可以清楚地識(shí)別出**邊緣，因此A&MMP@Ag₂S-AF7P只能在**組織中被精確激活。臨床免疫組化(IHC)結(jié)果進(jìn)一步表明A&MMP@Ag₂S-AF7P對(duì)NB**細(xì)胞具有較高的特異性。

圖3。A) 術(shù)中組織快速病理檢查示意圖。B) KP-N-NS荷瘤小鼠**組織切除后的熒光顯微鏡圖像及相應(yīng)的HE染色。C, D) MMP抑制劑GM6001治療的患者切除的**結(jié)節(jié)的NIR-II熒光和明亮視野圖像。T=**組織，N=正常組織。

作者通過(guò)腹腔接種過(guò)表達(dá)MMP14的人腎上腺NB細(xì)胞KP-N-NS來(lái)檢測(cè)腹腔轉(zhuǎn)移模型中體內(nèi)術(shù)中診斷的可行性。在成功地將制備好的A&MMP@Ag₂S-AF7P納米探針腹腔注射到小鼠體內(nèi)，劑量為2.5 mg×kg^-1，采用NIR-II成像系統(tǒng)進(jìn)行體內(nèi)熒光成像。最初，在小鼠的腹部觀察到無(wú)法檢測(cè)到的熒光。然后，荷瘤小鼠腹腔多個(gè)部位被NIR-II熒光點(diǎn)亮(圖4a)，熒光斑數(shù)量在45min內(nèi)保持相對(duì)穩(wěn)定，T/N比高。在NIR-II熒光成像的引導(dǎo)下，將這些斑點(diǎn)從小鼠體內(nèi)去除，同時(shí)以裸眼手術(shù)作為對(duì)照(每組5只)(圖4 B)。然后收集NIR-II熒光成像引導(dǎo)下和未引導(dǎo)下切除的結(jié)節(jié)，并進(jìn)行HE染色分析。結(jié)果A&MMP@Ag₂S-AF7P引導(dǎo)手術(shù)共切除44個(gè)結(jié)節(jié)，陽(yáng)性率84%，明顯優(yōu)于裸眼手術(shù)(62%)共切除33個(gè)結(jié)節(jié)(圖4C)。由于這種靶標(biāo)可激活的NIR-II熒光成像策略的高靈敏度和特異性，在NIRII熒光成像的指導(dǎo)下，可清晰識(shí)別125mm以下的**結(jié)節(jié)大小(圖4d)。**響應(yīng)性A&MMP@Ag₂S-AF7P納米探針具有優(yōu)越的T/N信號(hào)比和高靈敏度，能夠檢測(cè)微小的不可見病變，有助于在未來(lái)的臨床實(shí)踐中更高效、準(zhǔn)確的手術(shù)。

圖4。A) IP給藥A&MMP@Ag₂S-AF7P后腹膜**模型術(shù)前、術(shù)后NIR-II和明亮視野(BF)圖像。B)切除**結(jié)節(jié)的NIR-II熒光和BF圖像。比例尺= 5 mm。C)有無(wú)NIR-II熒光成像引導(dǎo)下**結(jié)節(jié)陽(yáng)性率直方圖。D) NIR-II引導(dǎo)下和未引導(dǎo)下切除的單個(gè)**直徑點(diǎn)圖。

由于NB起源于神經(jīng)嵴的胚胎交感腎上腺譜系，通常發(fā)生于腹部或腎上腺髓質(zhì)，作者采用瘤周組織中存在的主要細(xì)胞類型來(lái)檢測(cè)A&MMP@Ag₂S-AF7P的細(xì)胞攝取。A&MMP@Ag₂S-AF7P濃度為30 mg×m L^-1分別在37°C下保溫2小時(shí)。上述細(xì)胞對(duì)A&MMP@Ag₂S-AF7P的熒光激活影響很小，而NB KP-N-NS細(xì)胞可以很快被照亮，這意味著A&MMP@Ag₂S-AF7P對(duì)MMP14具有高特異性(圖5)。因此，進(jìn)一步證明了我們的納米探針對(duì)過(guò)表達(dá)的MMP14酶具有高度特異性的識(shí)別和激活NB，確保了其對(duì)NB的準(zhǔn)確和靈敏診斷。為了驗(yàn)證A&MMP@Ag₂S-AF7P的生物安全性，作者進(jìn)行了一系列的體外和體內(nèi)研究。MTT實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)分析表明，有聽不清細(xì)胞毒性KP-N-NS細(xì)胞和L929細(xì)胞與A&MMP@Ag₂S-AF7P孵化后24 h A&MMP@Ag₂SAF7P的濃度的增加(從0到160 mg×mL^-1),發(fā)生凋亡和壞死的KP-N-NS細(xì)胞和L929細(xì)胞數(shù)量與未加A&MMP@Ag₂S-AF7P處理的對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Balb/c小鼠在第1天和第7天，經(jīng)IP注射PBS溶液和A&MMP@Ag₂S-AF7P后，血液學(xué)評(píng)估和血液生化分析進(jìn)一步揭示了A&MMP@Ag₂S-AF7P對(duì)治療小鼠的毒性作用。與對(duì)照組相比，注射后1天和7天的血液學(xué)和生化指標(biāo)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。作者還獲得了Balb/c小鼠IP注射PBS溶液和A&MMP@Ag₂S-AF7P，提示無(wú)炎癥細(xì)胞或細(xì)胞壞死?；谝陨辖Y(jié)果，在成像濃度下，A&MMP@Ag₂S-AF7P對(duì)小鼠的毒性可以忽略。

圖5。顯微鏡熒光圖像顯示MMP14陽(yáng)性的KP-NNS與A&MMP@Ag₂S-AF7P處理后的腸上皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肝細(xì)胞和脾細(xì)胞。比例尺= 50 mm。

結(jié)論

作者成功地開發(fā)了一種**特異性酶激活NIR-II納米探針，用于快速無(wú)擾動(dòng)組織分析，用于離體和體內(nèi)NB診斷。A&MMP@Ag₂S-AF7P既包含MMP14靶向肽AF7P，又包含其在聚陽(yáng)離子細(xì)胞穿透肽(R9)和聚陰離子片段(E8)之間的可剪切連接子。Ag₂S量子點(diǎn)的NIR-II熒光通過(guò)過(guò)表達(dá)MMP14特異性識(shí)別NB細(xì)胞后，由于FRET的破壞而迅速激活，同時(shí)膜穿透肽R9暴露導(dǎo)致納米探針在NB細(xì)胞內(nèi)高效內(nèi)化。獨(dú)家NB細(xì)胞染色，染色時(shí)間很短，沒(méi)有組織固定和冷凍切片，分子水平的精確診斷，以及良好的生物相容性，使a&MMP@Ag2S-AF7P納米探針足夠作為快速診斷試劑納入癌癥手術(shù)或組織活檢程序。該策略可擴(kuò)展到其他**，實(shí)現(xiàn)術(shù)中檢測(cè)和精確手術(shù)，具有很大的臨床應(yīng)用潛力。

參考文獻(xiàn)

Rapid Unperturbed-Tissue Analysis for Intraoperative Cancer Diagnosis Using an Enzyme-Activated NIR-II Nanoprobe, Yang Zhan, Sisi Ling, Haoying Huang, Yejun Zhang, Guangcun Chen, Shungen Huang, Chunyan Li,* Wanliang Guo,* Qiangbin Wang*, Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 2637 –2642. DOI: 10.1002/anie.202011903.

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202011903

產(chǎn)品提供

靶向NIR-II熒光納米探針