- 029-86354885
- 18392009562
內(nèi)容提要
通過將NO結(jié)合的Fe?S團(tuán)簇?fù)饺?/span>脫鐵蛋白腔體,構(gòu)建了具有高負(fù)載效率的光活性NO釋放系統(tǒng)。該系統(tǒng)保持了完整的核-殼結(jié)構(gòu),顯示具有強(qiáng)的穩(wěn)定性、降低細(xì)胞毒性、高效的細(xì)胞攝取和光控NO釋放等優(yōu)點(diǎn)。
前言
NO作為第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的氣體信號分子,已被證實(shí)參與神經(jīng)傳遞、心血管活動(dòng)和免疫系統(tǒng)。NO在疾病過程中的積極和消極作用,如**生長或抑制,與NO的產(chǎn)生水平和細(xì)胞敏感性密切相關(guān)。通過外源性NO作為治療藥物遞送到活的惡性細(xì)胞,可以干擾NO介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或**進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的病理途徑。但是,外源NO的治療效果受其半衰期短和對生物物質(zhì)的易變性的限制,這個(gè)問題傳統(tǒng)是通過NO供體來解決,如壬酸鹽和s-亞硝基硫醇衍生物,這些供體在生理?xiàng)l件下不穩(wěn)定,釋放氣態(tài)NO。為了滿足空間和時(shí)間控制NO釋放的關(guān)鍵要求,光活性NO供體可以利用光作為受控激活的觸發(fā)器。天然脫鐵蛋白因其可逆重組特性和對過表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的**細(xì)胞的特異性結(jié)合親和力而獨(dú)特,直徑約為8 nm的大空腔允許客體分子大量聚集,已經(jīng)成為藥物傳遞、細(xì)胞成像、納米反應(yīng)器的理想平臺(tái)。本論文將脫鐵蛋白與路森黑鹽(RBS)耦合,構(gòu)建一個(gè)多重NO結(jié)合的鐵-硫簇/蛋白質(zhì)復(fù)合物,在不需要內(nèi)表面工程的情況下提高負(fù)載能力,光控NO釋放,高NO供應(yīng)水平,Fe-NO解離后細(xì)胞毒性鐵離子的保留,促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)內(nèi)化。
圖1. (a)脫鐵蛋白及其RBS和RRS化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖;(b) RBS嵌入和光誘導(dǎo)NO釋放的說明;(c)RBS/蛋白復(fù)合材料胞內(nèi)內(nèi)化和光誘導(dǎo)胞內(nèi)NO釋放的示意圖。
在pH恒定為7.4的10%乙腈/PBS緩沖液中,以鐵原子與蛋白質(zhì)的摩爾比為500:1,將RBS負(fù)載到脫鐵蛋白中。用10%乙腈/PBS透析,再用PD-10柱純化,得到一個(gè)棕色的RBS-蛋白復(fù)合物(RBS-NP)溶液。通過KMnO4氧化法和電感耦合等離子體發(fā)射光譜(ICP-OES)分析,估計(jì)每個(gè)蛋白質(zhì)的Fe負(fù)載量分別為213和201個(gè)原子。以醋酸鈾酰為陰性染色劑,通過HR-TEM證實(shí)了RBS-NP完整的結(jié)構(gòu),與脫鐵蛋白相似,顯示透明的外殼和致密的核被醋酸鈾酰染色(圖2a)。非染色的HR-TEM,RBS-NPs可見為與蛋白腔大小相當(dāng)?shù)陌唿c(diǎn)(圖2a)。在籠內(nèi)大量積累了RBS,可能是由于Fe - S簇與組氨酸、精氨酸和色氨酸等氨基酸殘基的相互作用以及籠內(nèi)疏水環(huán)境。RBS-NPs的平均水合直徑略大于脫鐵蛋白(12.9±2.6 nm vs 10.0±0.9 nm)。如圖2c所示,圓二色(CD)光譜中193 nm處的正峰和208、222 nm處的負(fù)峰均為常數(shù)(圖2c),說明RBS摻入過程確保了蛋白殼的α-螺旋和β片保持在原始狀態(tài)。
圖2. (a) 醋酸鈾酰染色的脫鐵蛋白和RBS-NP,以及未染色的RBS-NP的HR-TEM圖像(標(biāo)尺為50 nm,內(nèi)徑為10 nm);(b)脫鐵蛋白、RBS-NP和光處理RBS-NP的DLS分析;(c)脫鐵蛋白、RBS-NP和光處理RBS-NP的CD光譜。
白光LED照射(12 mW/cm2, 60 min)使NO完全釋放后,RBS在320 ~ 500 nm范圍內(nèi)的吸收帶在PBS (pH 7.4)中消失。光照射引起了RBS-NP的吸收光譜相同的變化,這表明Fe?NO鍵被摻入過程打斷,并保持了光活性(圖3a)。RBS和RBS-NP的NO積累呈線性時(shí)間依賴性,其穩(wěn)定速率分別為4.6 μM/min和3.3 μM/min(圖3b)。由于RBS在水介質(zhì)中的穩(wěn)定性有限,即使小心地保護(hù)不受光,在RBS溶液中也很容易檢測到NO。在RBS-NP溶液中,初始NO水平明顯降低,表明RBS在疏水環(huán)境中籠化提高了RBS的穩(wěn)定性。因此,RBS-NP可作為一種光控釋放NO的平臺(tái)而不會(huì)對籠狀結(jié)構(gòu)造成損傷。
圖3. (a) RBS-NP在光照前后的吸收光譜;(b)由RBS和RBS- np產(chǎn)生的NO濃度隨光照時(shí)間的變化曲線。
因?yàn)?/span>Fe - S團(tuán)簇被籠化而不是被脫鐵蛋白外殼吸收,所以脫鐵蛋白材料的細(xì)胞內(nèi)化不會(huì)受到Fe - S團(tuán)簇的影響。作者對兩種**細(xì)胞系HeLa和MCF-7進(jìn)行了體外光活性和毒性實(shí)驗(yàn)。RBS-NP 16 h的細(xì)胞培養(yǎng),用PBS洗滌,DCF-FM DA染色,白光LED曝光(12 mW /cm2) 30分鐘。在熒光顯微鏡下,RBS-NP處理的HeLa細(xì)胞的亮綠色圖像反映了有效的細(xì)胞攝取和光誘導(dǎo)的NO釋放(圖4a)。經(jīng)過RBS或RBS-NP處理的MCF-7細(xì)胞和光處理后,其熒光強(qiáng)度明顯降低,可能是由于細(xì)胞內(nèi)清除反應(yīng)的存在縮短了NO壽命。為了研究細(xì)胞反應(yīng)是否與細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平有關(guān),我們使用熒光反應(yīng)氧物種(ROS)探針DCFH-DA對H2O2處理的HeLa和MCF7細(xì)胞進(jìn)行了成像,無論光照與否。光暴露不影響ROS水平。與HeLa細(xì)胞不同,MCF-7細(xì)胞在H2O2的作用下表現(xiàn)出ROS水平的抑制,而HeLa細(xì)胞則表現(xiàn)出細(xì)胞內(nèi)ROS水平的升高。因此,氧化應(yīng)激反應(yīng)似乎存在細(xì)胞類型依賴機(jī)制。
MTT法測定了RBS和RBS-NP在黑暗條件下的細(xì)胞毒性。在0.5、1、2、3、4、6、8和10 μg/mL鐵濃度下,分別用RBS或RBS-NP處理HeLa和MCF細(xì)胞48 h,然后進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)。在HeLa細(xì)胞中,RBS和RBS-NP的IC50值分別為3.7和5.4 μg/mL Fe(圖4b)。在MCF-7細(xì)胞中,也觀察到相對于RBS,暗色RBS-NP的細(xì)胞毒性降低。對于正常細(xì)胞,RBS和RBS-NP在人肝細(xì)胞QSG細(xì)胞上表現(xiàn)出類似的鐵濃度依賴性的存活率,IC50值增加到約10 μg/mL。此外,研究了NO釋放對HeLa和MCF-7細(xì)胞的光毒性作用。細(xì)胞治療與RBS或RBS-NP鐵劑量為1.0μg/mL 16 h,然后被白光LED曝光(12 mW/cm2)不同分鐘(0、5、10、15、20、25、30分鐘),與PBS再孵育24小時(shí)。如圖4c所示,用脫鐵蛋白處理HeLa細(xì)胞,或光處理,或暗處理RBS,或暗處理RBS-NP均不影響細(xì)胞活力。RBS或RBS-NP處理過的MCF-7細(xì)胞表現(xiàn)出更高的光照耐受性,這是由于上述MCF-7細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的抑制。細(xì)胞以不同的途徑吸收RBS和RBS-NP。小尺寸疏水的RBS具有細(xì)胞膜通透性,而RBS-NP只能通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用內(nèi)化,導(dǎo)致鐵攝取速率的差異。HeLa和MCF細(xì)胞治療由RBS和在同一初始RBS-NP鐵濃度(3μg/mL)在無血清培養(yǎng)基遠(yuǎn)離光1或2 h。對于HeLa細(xì)胞,在孵育后1 h和2 h, RBS-NP處理導(dǎo)致鐵的攝入量分別比RBS多14和5.3%;對于MCF-7細(xì)胞,在1和2小時(shí)內(nèi),RBS-NP處理比RBS分別增加了18和12%的鐵攝入量。因此,RBS的吸收可以通過籠狀策略增強(qiáng)。
圖4。(a)使用DCF-FM DA作為NO探針,在光照前和光照后使用RBS或RBS-NP處理的HeLa細(xì)胞的熒光圖像;(b)不同Fe濃度下RBS和RBS- np處理HeLa細(xì)胞的MTT分析;(c)不同照射時(shí)間下,脫鐵蛋白或RBS或RBS- np處理的HeLa細(xì)胞的MTT分析。
結(jié)論
作者在pH 7.4下將光活性Fe-S團(tuán)簇加入脫鐵蛋白的籠子內(nèi)部,避免了傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)分解重組過程。體積龐大的RBS復(fù)合物以42%的負(fù)載效率封裝。疏水蛋白籠對水敏感的RBS具有顯著的穩(wěn)定性,納米級復(fù)合材料可保存在PBS緩沖液中,且至少有2個(gè)月的保質(zhì)期。RBS復(fù)合材料的高效細(xì)胞攝取和光控NO釋放特性允許細(xì)胞類型依賴性的藥物應(yīng)用于基于NO的治療。
參考文獻(xiàn)
Xiao Li, Yajie Zhang, Jian Sun, Weijian Chen, Xuewei Wang, Fenli Shao, Yuyu Zhu, Fude Feng* , Yang Sun*,Protein Nanocage-Based Photo-Controlled Nitric Oxide Releasing Platform, ACS Appl. Mater. Interfaces, 2017, 9, 19519?19524. DOI: 10.1021/acsami.7b03962. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsami.7b03962
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