- 029-86354885
- 18392009562
內容提要
近年來,活細胞中一氧化碳(CO)的熒光檢測備受關注。由于缺乏有效的構建CO熒光探針的方法,活細胞中CO的熒光檢測仍處于起步階段。本文首次報道以烯丙基醚為反應位點構建CO熒光探針的方法。通過這種方法制備了兩種易獲得的烯丙基熒光素醚,它們是在PdCl2存在下對CO具有高度選擇性和敏感性的探針。這些探針具有穩定性好、水溶性好、比色性好、熒光開啟信號變化顯著等優點,可以用很低的劑量檢測和跟蹤活細胞中的CO,有望成為生物系統中檢測CO非常有前途的生物工具。
前言
一氧化碳(CO)可以在人體的血紅素分解代謝過程中內源性產生,它已被證明是一種重要的細胞信號分子,可以保護我們免受血管疾病、炎癥甚至癌癥的傷害,引起了對CO的前所未有的關注。隨著CO在生物學中的研究不斷深入,開發選擇性、靈敏的方法實時跟蹤生命系統中的這種小氣體分子具有重要的科學意義。由于熒光檢測方便、靈敏度高、實時無損檢測等優點而倍受青睞。CO熒光探針的構建仍處于很早期的階段,目前報道CO熒光探針主要使用遺傳編碼蛋白和有機鈀配合物,要么需要大量復雜的加工,要么難以合成,響應時間較長(30 ~ 60分鐘),因此迫切需要開發新的方法來構建具有優良傳感性能的一氧化碳熒光探針。作者最近使用了廉價、高熒光熒光素和眾所周知的Pd(0)介導的Tsuji-Trost反應,開發了一種易于獲得的CO熒光開啟探針(FL-CO-1),該方法對CO具有良好的傳感性能,可方便地用于活細胞中CO的檢測。由于碳酸烯丙基保護基團的穩定性不夠,FL-CO-1的穩定性不是很好。為了解決這個問題,作者研究了第二代以烯丙基醚為保護基團和反應位點的CO熒光素探針(探針1和探針2)。烯丙基醚相對于碳酸烯丙基更穩定。烯丙基也很容易被Pd(0)介導的Tsuji?Trost反應去除。這些烯丙基醚具有良好的穩定性,可以方便地用于CO的體外和活細胞檢測,且性能優良傳感特性,為設計CO熒光探針提供了一種新的方法。
結果與討論
作者首先將探針1和探針2與我們的第一代基于熒光素的CO探針(FL-CO-1)進行了穩定性比較。由于熒光素結構的內酯形式,探針1和探針2在PBS緩沖液中都是非熒光的。然而,探針FL-CO-1在PBS緩沖液中隨著時間的推移顯示出相當大的熒光增強,這表明它對pH值很敏感)。此外,FL-CO-1對紫外光也很敏感。探針1和探針2在相同的條件下沒有顯示任何變化。探針1和2具有良好的穩定性和優良的光穩定性,遠遠優于FL-CO-1。探針1和2對Pd2+沒有響應,但對Pd(0)顯示出快速和顯著的熒光增強。考慮到Pd2+可以被CO原位快速還原為Pd(0),因此,1和2可以作為CO的候選探針。以CORM-3為水溶性CO的緩釋劑,研究了探針1和探針2在PdCl2存在下對CO的響應。如圖1所示,添加CORM-3,5 μM探針+ 5 μM PdCl2在PBS緩沖(10 mM,pH值7.4)顯示快速熒光刺激反應,在20分鐘內,兩個探針的熒光強度的解決方案都增強了150倍。因此,在探針1和探針2的溶液中都可以觀察到強烈的黃綠色熒光(圖1a和c)。因此探針1和探針2都可以作為熒光探針在溫和的條件下快速檢測水溶液中的CO。
圖1。在37℃PBS緩沖液(10 mM, pH 7.4)中加入CORM-3 (100 μM)后,探針體系(5 μM探針+ 5 μM PdCl2)的熒光光譜發生變化。(a)添加CORM-3后的探針1。(b)探針1在516 nm處的熒光強度比F/F0隨時間的變化。(c)添加CORM-3后的探針2。(d)探針2在527 nm處的熒光強度比(F/F0)隨時間的變化。在365 nm的光下,發射光譜的顏色變化分別插入(a)和(c)。
在探針1和探針2溶液中加入不同濃度的CORM-3。動力學實驗表明,加入CORM-3 (10 ~ 400 μM)后,1和2的反應均順利進行,產生劑量和時間依賴性的熒光增強。在熒光光譜的變化中,隨著CORM-3濃度的逐漸增加,兩種探針溶液的熒光均呈逐漸增加的趨勢大約520 nm,直到逐漸接近飽和。探針的熒光變化和CORM-3濃度(0?50 μM)呈現出良好的線性關系(圖2)。探針1和2的檢測限分別為46 nM(~1.3 ppb)和29 nM (~0.8 ppb)。
圖2。(a)添加不同濃度的CORM3 (0 ~ 50 μM)后探針1 (探針1 + PdCl2,各5 μM)的熒光光譜變化。(b)探針1在516 nm處的熒光強度隨0 ~ 50 μM濃度的變化呈線性關系。(c)加入不同濃度的CORM-3 (0 ~ 50 μM)后,探針2 (探針2 + PdCl2,各5 μM)的熒光光譜變化。(d)探針2在527 nm處的熒光強度隨0 ~ 50 μM濃度的變化呈線性關系。所有數據采集于PBS緩沖液(10 mM, pH 7.4)中,37℃,混合20 min后獲得各光譜。
選擇性的探針1和2對近40種不同分析物包括常見的陰離子,如F-,Cl?,Br?,AcO?,HCO3?,N3?,NO3?,SO42?, HSO4?,HSO3?,HS?, SCN?,CN?,ClO4?,IO4?,P O43?,HPO42?,生物硫醇如Cys、Hcy、GSH,氨基酸如Ser,Trp,Ala,Phe,Gln,Glu,Lys,Leu,Gly和Ile,以及活性氧/氮(ROS/RNS),如ClO?,H2O2,NO2?,NO,HNO,ROO?,tBuOO?和?OH。如圖3所示,只有添加CORM-3時,探針1和探針2溶液的熒光增強效果顯著,而其他分析物的熒光增強效果幾乎為0。探針1和2系統對CO都具有高度選擇性。
圖3。探針1和探針2溶液對不同分析物(100 μM)的熒光光譜和熒光強度響應。(a, b)探針1溶液(探針1 + PdCl2各5 μM)。(c, d)探針2溶液(探針2+PdCl2,各5 μM)。各種分析物(1)SO42?,(2)HSO4?,(3)HSO3?,(4) AcO?,(5)F?, (6) Cl?, (7)Br?, (8)I-, (9)ClO?, (10)IO4?, (11)ClO4?, (12) NO3-, (13)SCN?, (14) CN?, (15)N3?, (16) HCO3?, (17) ROO?, (18) NO,(19)H2O2, (20)tBuOO?, (21) HNO,(22)?OH, (23) HS?, (24)Cys, (25)Hcy, (26) GSH,(27)Ser, (28) Trp, (29)Ala, (30)Phe, (31)Gln, (32) Glu (32), (33) Lys, (34) Leu, (35) Gly, (36) Ile, (37) Pd2+, (38) CORM-3。在37°C PBS緩沖液(10 mM, pH 7.4)中混合20分鐘后監測所有光譜。
兩種CO探針系統的光學變化均顯示出相應的高熒光熒光素的形成。為了證實這一點,探針1和2的反應混合物受到質量和TLC分析。反應混合物的質量分析(探針1+PdCl2+CORM-3) ,5分鐘表現出明顯的峰值為333.0779,說明反應確實產生了熒光素。合成單烯丙基熒光素醚并作為薄層色譜分析的參考樣品,TLC分析結果清楚地表明,該反應經過了一個單烯丙基醚中間體,然后轉化為熒光素作為最終產物。探針2的反應混合物的質量和薄層色譜分析也可以得到類似的結果。這些結果表明,探測系統對CO的傳感機制圖下圖所示。
圖4。探針1和2檢測CO的傳感機制
受其溶液條件下優異性能的鼓舞,研究了探針1和探針2在活細胞CO成像中的潛在應用。MTT分析表明,探針1系統對活細胞具有極低的細胞毒性;甚至可以達到50 μM。探針2系統對活細胞顯示了一定程度的細胞毒性,這可能是由于鹵素原子的存在。由于探針1和探針2都是高度敏感的,我們可以使用探針在很低的劑量(1μM)對活細胞中的CO進行熒光成像。圖5結果表明,用1 μM探針1對活HeLa細胞中的CO進行成像。可以看到,當HeLa細胞與探針1或探針1與PdCl2(每個探針1 μM)孵育30分鐘時,沒有觀察到熒光(圖5A1,B1)。當細胞用CORM3預孵育,然后用探針系統孵育(探針1+PdCl2,各1 μM)時,觀察到劑量依賴性的細胞內熒光(圖5C1?E1)。當探針2的探針尺寸為1 μM時,可以觀察到類似的結果。探針1和探針2都可以用于檢測活細胞中的CO。
圖5. 利用探針1系統(探針1 + PdCl2,每個探針1 μM)對HeLa細胞中的CO進行熒光成像。A?E:亮場圖像。最底層A1?E1: A?E的熒光圖像,激發波長為450 ~ 480 nm。(A1)細胞孵化與探針1(1 μM) 30分鐘。(B, B1)細胞孵化與探針1和PdCl2(1μM) 30分鐘。(C和C, D和D1, E和E1)細胞preincubated 1、5和10μM的CORM-3 30分鐘,然后用探針1和PdCl2(1 μM) 30分鐘,分別。比例尺= 20 μm。
在活細胞中,血紅素可以刺激更多的血紅素加氧酶(HO)衍生的CO,我們也研究了探針1和2檢測血紅素處理后內源性CO的能力。如圖6所示,當細胞與血紅素在探針1和PdCl2的混合物(各1 μM)孵育前,細胞顯示時間依賴性的熒光增強(圖6A1?C1)。這說明血紅素處理內源性CO產生的過程可以通過探針1跟蹤。如果使用探針2,可以觀察到類似的結果。因此,這些結果表明探針1和探針2對內源性CO有很大的成像潛力。
圖6。利用探針系統(探針1 + PdCl2)對HeLa細胞中亞鐵血紅素刺激產生的CO進行熒光成像。上行A?C和下行A1?C1分別為亮場圖像和相應的熒光圖像,激發波長為450 ~ 480 nm。100 μM血紅素預孵育1 h (A, A1)、5 h (B, B1)和10 h (C, C1),然后分別用探針系統(探針1 + PdCl2,各1 μM)孵育30 min。比例尺= 20 μm。
結論
作者首次報道了將烯丙基醚作為反應位點開發出兩種新的CO熒光探針。這兩種CO探針表現出比我們最近報道的基于烯丙基碳酸酯的CO熒光探針更好的穩定性,更重要的是,在PdCl2的存在下,這兩種探針對CO都表現出了良好的傳感性能。它們還可以方便地用于活細胞中CO的成像。本研究不僅提供了兩種新的有前途的CO熒光探針,而且為開發有效的用于活細胞CO檢測的熒光探針提供了新的思路。
參考文獻
Shumin Feng, Dandan Liu, Weiyong Feng, Guoqiang Feng*, Allyl Fluorescein Ethers as Promising Fluorescent Probes for Carbon Monoxide Imaging in Living Cells, Anal. Chem. 2017, 89, 3754?3760. DOI: 10.1021/acs.analchem.7b00135. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.7b00135
產品提供
序號 | 新聞標題 | 瀏覽次數 | 作者 | 發布時間 |
---|---|---|---|---|
1 | 瑞禧定制-功能化1,2,4,5-四嗪Cis-[Pt-1,3-Propanediamine]-2-Me-Tetrazine/IC-MethylTetrazine | 618 | 瑞禧生物 | 2022-11-09 |
2 | 科研-四嗪Py-Tetrazine-PEG1-Alkyne/Py-PEG1-Alkyne/Pyrimidine-Tetrazine-PEG1-Alkyne | 629 | 瑞禧生物 | 2022-11-09 |
3 | 胺基與NHS活性酯反應PEG之Azido-PEG7-amine/1333154-77-0瑞禧生物 | 1297 | 瑞禧生物 | 2023-01-03 |
4 | 瑞禧2023更新 Azido-PEG8-acid疊氮八聚乙二醇羧酸 | 549 | 瑞禧生物 | 2023-01-03 |
5 | 嵌段共聚物4 arm-PEG-TK-NH2 /NHS/MAL | 625 | 瑞禧生物 | 2022-12-08 |
6 | 活性氧敏感聚合物TK-PPE 酮縮硫醇-聚磷酸酯 PPE-TK | 674 | 瑞禧生物 | 2022-12-08 |
7 | 功能化腙鍵響應性磷脂 DSPE-Hyd-PEG-Alkyne/CHO/cRGD 醛基/多肽 | 674 | 瑞禧生物 | 2022-12-08 |