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內(nèi)容提要

由于顱骨強(qiáng)光衰減和高背景干擾，腦膠質(zhì)瘤邊緣的確認(rèn)仍然是精確成像和靶向治療的挑戰(zhàn)。近紅外二區(qū)(NIR II)光聲成像(PAI)具有較深的穿透性和較高的靈敏度，在腦膠質(zhì)瘤成像中具有很大的潛力。本文合成了包裹克酮酸染料A1094的多肽RGD修飾的乙型肝炎病毒核心蛋白(A1094@RGD-HBc)，利用A1094的聚集誘導(dǎo)吸收增強(qiáng)機(jī)制（AIAE）用于腦膠質(zhì)瘤的NIR II PAI。A1094@RGD-HBc具有增強(qiáng)的近紅外二區(qū)吸收，在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)了9倍的PA信號放大，腦膠質(zhì)瘤的PAI深度可達(dá)5.9 mm，同時，¹³¹I標(biāo)記的A1094@RGD-HBc可以精確共定位獲得高分辨率PAI和超靈敏的腦膠質(zhì)瘤單光子發(fā)射斷層圖像（SPECT），展示其在腦膠質(zhì)瘤的診斷成像和精確治療的臨床應(yīng)用上的巨大前景。

前言

腦膠質(zhì)瘤是世界范圍內(nèi)最致命的顱內(nèi)惡性**，預(yù)后差，死亡率高。目前，影像學(xué)檢查后的積極手術(shù)切除是臨床的標(biāo)準(zhǔn)治療方法。目前的診斷和治療由于不準(zhǔn)確的**位置評估和模糊的手術(shù)邊緣的大腦。強(qiáng)烈的光衰減和散射在顱骨往往阻礙光穿透，采用光學(xué)方法探測大腦深部區(qū)域變得困難。因此，迫切需要一種能夠準(zhǔn)確確認(rèn)深部腦膠質(zhì)瘤手術(shù)邊緣的高靈敏度成像方法。光聲成像(PAI)以其單模態(tài)的高空間分辨率和豐富的對比度，近年來受到了科學(xué)家和醫(yī)生的廣泛關(guān)注。這種新技術(shù)與有效的PA成像劑是有用的疾病監(jiān)測，特別是在早期治療和非侵入性**成像。由于灰質(zhì)比周圍組織(包括肌肉和脂肪組織)表現(xiàn)出更高的散射和更強(qiáng)的吸收，需要高劑量的藥物增強(qiáng)成像反差，這可能會導(dǎo)致嚴(yán)重的不良反應(yīng)或毒性；腦膠質(zhì)瘤檢測和治療的另一個挑戰(zhàn)是如何克服血腦屏障(BBB)將藥物輸送到**組織。因此發(fā)展出安全有效的以膠質(zhì)瘤為靶點(diǎn)的NIR II強(qiáng)吸收的有機(jī)探針對于腦疾病的深層PAI尤為重要。作者報(bào)道了π- π共軛的有機(jī)分子A1094，在生物相容性載體中聚集時表現(xiàn)出優(yōu)異的聚集誘導(dǎo)吸收增強(qiáng)(AIAE)，并用于深層PAI(方案1a)，其機(jī)理歸因于HOMO和LUMO之間的能隙共振增強(qiáng)(方案1b)，增強(qiáng)聚集體的光吸收。本文通過巧妙的設(shè)計(jì)和分子工程證實(shí)了AIAE效應(yīng),在適當(dāng)?shù)臐舛确秶鷥?nèi)，A1094@RGD-HBc的NIR II窗口顯示出非線性吸收，并首次應(yīng)用于深部腦膠質(zhì)瘤的PAI。

結(jié)果與討論

A1094的HOMO和LUMO軌道能量分別為?4.47和?3.57 eV，近紅外吸收的能帶隙很小。在圖1a中，A1094在1094 nm處有很強(qiáng)的吸收峰（圖1a），在乙醇、甲醇、二甲基亞砜(DMSO)等有機(jī)溶劑中溶解良好。A1094在不同pH下表現(xiàn)出不同的吸收水平。A1094在酸性pH值(4.1-5.9)中具有較強(qiáng)的吸收能力，這表明A1094適合作為探針用于**酸性微環(huán)境成像。在白光或激光照射下，A1094在二氯甲烷中是穩(wěn)定的。即使?jié)舛鹊椭?/span>62.5 μg mL^?1DMSO溶液中，A1094的PA性質(zhì)也表現(xiàn)出較高的檢測靈敏度(圖1c) 。將A1094被封裝到RGD-HBc蛋白中，聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和Western Blot分析證實(shí)了RGD-HBc的活性。動態(tài)光散射和透射電鏡均顯示A1094@RGD-HBc的直徑在30 nm左右(圖1d和1e)。在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，以及在980 nm激光照射下(0.5 W cm^?2,10 min)， A1094@RGD-HBc的優(yōu)良光熱穩(wěn)定性。將A1094加載到RGD-HBc蛋白后，在NIR II區(qū)明顯出現(xiàn)AIAE(圖1f)。即使在很低的濃度(25 μg mL^?1)下，A1094@RGD-HBc也具有很強(qiáng)的吸收強(qiáng)度，且呈非線性關(guān)系。為了進(jìn)一步說明AIAE的作用機(jī)制，我們將A1094@RGD-HBc用DMSO解離，使RGD-HBc蛋白釋放出A1094，從而導(dǎo)致NIR II吸收減少而在Oil Red O@RGD-HBc中，未發(fā)現(xiàn)AIAE效應(yīng)。為了研究RGD對人原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(U87MG)的選擇性，U87MG細(xì)胞分別與RGD-HBc、HBc和PBS孵育。RGD-HBc孵育12 h后，細(xì)胞的熒光強(qiáng)度比PBS處理的細(xì)胞亮9.6倍，比HBc處理的細(xì)胞亮1.6倍(圖1g)。共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示A1094@RGD-HBc比A1094@HBc更特異的細(xì)胞攝取(圖1h)。

圖1. a) A1094在甲醇中的梯度吸收光譜(40-80 μg mL^?1)。b) A1094在DMSO 950 nm處不同濃度(0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0 mg mL^?1)的PA圖像。c) DMSO中A1094濃度對PA振幅的影響。d) A1094@RGD-HBc透射電子顯微鏡。e) A1094@RGD-HBc的動態(tài)光散射。f) A1094@RGD-HBc在90% DMSO破壞蛋白前后的吸收光譜。g)流式細(xì)胞術(shù)分析U87MG細(xì)胞與RGD-HBc和HBc孵育后不同時間點(diǎn)的變化。h)用標(biāo)記為A1094@RGD-HBc和A1094@HBc的Cy5.5孵育U87MG細(xì)胞后的熒光圖像。

在A1094@RGD-HBc的NIR II區(qū)高效的靶向性和高增強(qiáng)的吸收，促使我們進(jìn)一步探索其在不同波長的吸收(圖2 a)。1200-1300 nm處聚集體的PA振幅明顯強(qiáng)于800-950 nm處(圖2c)，說明AIAE的性能。圖2d顯示了具有AIAE特性的1200 nm處顯著的PA振幅。PA信號在解聚狀態(tài)下表現(xiàn)出微弱的PA信號，表明增強(qiáng)的PA振幅是由A1094聚集引起的。將A1094@RGD-HBc皮下注射到小鼠皮膚中。在1200 nm左右的激發(fā)下檢測到優(yōu)良的PA信號(圖2b)，無AIAE特性的對比在體內(nèi)表現(xiàn)出較低的PA信號。RGD-HBc中A1094的聚集可在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)9倍吸收增強(qiáng)，表明其作為深部腦**PAI具有明顯優(yōu)勢(圖2e)。考慮到在小鼠顱骨中已被證明在1064 nm處相對較弱的光衰減，選擇1064 nm進(jìn)行體內(nèi)原位腦膠質(zhì)瘤的PAI。

圖2. 探針在800-1400 nm解聚前后的PAI a)體外，b)體內(nèi)。c) (a)對應(yīng)PA信號強(qiáng)度。d) PA信號在1200 nm處在150分鐘內(nèi)的穩(wěn)定性A1094@RGD-HBc。 e) (b)對應(yīng)PA信號強(qiáng)度。

利用自制的聲分辨光聲顯微鏡(AR-PAM，圖3 a)，經(jīng)過低劑量A1094@RGD-HBc(100 μg×mL^?1)靜脈注射，PA模型監(jiān)測A1094@ RGD-HBc的積累，超聲(US)模型顯示**位置(圖3b-d)。PA和US的b級掃描顯示，**來自腦皮膚的深度為5.9 mm (圖3e-g)。由于AIAE的性質(zhì)，A1094@RGD-HBc的劑量僅為ICG@RGD-HBc的四分之一。

圖3。a) AR-PAM系統(tǒng)用于U87MG荷瘤小鼠成像。OPO:光參量振蕩器;NDF:中性密度濾波器;M:鏡子;HWP:半波板;L:鏡頭;ConL:凸透鏡;BS:分束器;FC:光纖耦合器;帕金森病:光電二極管;CL:錐形透鏡;WT:水箱;UPR:超聲波脈沖發(fā)生器/接收器;DAQ:數(shù)據(jù)采集卡;PC:個人電腦。b) PA, c) US，和d) U87荷瘤小鼠合并的大腦圖像。e) PA, f) US, g)注射后2 h**合并圖像對應(yīng)的b掃描圖。

注射后2 h后，偽彩色顯示**在1064 nm處增強(qiáng)的PA信號(圖4a)，而灰色顯示顱骨的共定位圖像，A1094@RGD-HBc作為一種有效的腦**PA成像劑。經(jīng)過¹³¹I標(biāo)記的 ¹³¹I-A1094@RGD-HBc SPECT/CT圖像顯示，注射后2小時**放射性攝取增強(qiáng)(圖4b)，這與PAI結(jié)果一致。成像后，腦組織用于放射自顯影研究，并收集主要器官進(jìn)行H&E染色。與正常腦片相比，**腦片具有較高的放射性攝取，具有良好的特異性(圖4c)。結(jié)果表明，¹³¹I-A1094@RGD-HBc具有極高的效率、特異性和生物相容性，可作為原位深部腦膠質(zhì)瘤PAI和超靈敏SPECT成像的理想造影劑。

圖4。活體PA/US和microSPECT/CT成像。a) PA/US圖像和b) U87MG荷瘤小鼠在注射¹³¹I放射性標(biāo)記A1094@RGD-HBc后2小時的大腦SPECT/CT圖像。c)注射¹³¹I-A1094@RGD-HBc后，對照組(左)和荷瘤組(右)的放射自顯像。比例尺= 2毫米。R:吻鼻靜脈;S:矢狀竇;T:橫竇。

結(jié)論

本研究利用AIAE機(jī)制，克服傳統(tǒng)發(fā)色團(tuán)聚集猝滅效應(yīng)而對成像的不利影響，實(shí)現(xiàn)在NIR II窗口對腦深部**PAI的作用。A1094@RGD-HBc在有限的空間封裝成蛋白載體后，表現(xiàn)出增強(qiáng)的NIR II吸收和強(qiáng)大的PA造影增強(qiáng)能力，在原位腦深部**成像中具有廣闊的應(yīng)用前景。利用AIAE效應(yīng)這種光吸收過程來構(gòu)建合適的吸收聚集體，表現(xiàn)出優(yōu)異的光穩(wěn)定性、特異性**靶向性和高效的濃度依賴性吸收，可以將其深度PAI的優(yōu)勢延伸到臨床轉(zhuǎn)化。

參考文獻(xiàn)

Yajing Liu, Huanhuan Liu, Huixiang Yan, Yingchao Liu, Jinsen Zhang, Wenjun Shan, Puxiang Lai, Honghui Li, Lei Ren, Zijing Li,* and Liming Nie*, Aggregation-Induced Absorption Enhancement for Deep Near-Infrared II Photoacoustic Imaging of Brain Gliomas In Vivo, Adv. Sci. 2019, 6, 1801615. DOI: 10.1002/advs.201801615. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.201801615

產(chǎn)品提供

克酮酸染料A1094

外觀：粉末黑色，溶液紫紅色

純度：95%以上

溶解性：脂溶性 DMSO DMF 等溶解

保存條件:-20度 避光 保存

備注：相關(guān)檢測/圖譜均有提供。

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